應(yīng)用快速DNA修飾方法尋找白血病DNA甲基化腫瘤標(biāo)志物.pdf

1、表觀遺傳學(xué)成為最近幾年生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，DNA甲基化作為其三個(gè)重要組成部分之一，是研究相對(duì)比較充分的部分，它對(duì)于腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后起著關(guān)鍵的作用，在腫瘤細(xì)胞與DNA甲基化之間的聯(lián)系初現(xiàn)端倪的時(shí)候，研究人員意識(shí)到DNA甲基化作為診斷標(biāo)志物會(huì)給腫瘤的診斷和觀察提供一個(gè)全新的視角。 隨著對(duì)DNA甲基化研究的深入，人們對(duì)其生物學(xué)意義有了深刻的認(rèn)識(shí)，但對(duì)于基因甲基化相關(guān)檢測(cè)方法的研究卻是在近十幾年才得到廣泛開展。要在DNA甲基化基

2、礎(chǔ)研究和應(yīng)用領(lǐng)域取得進(jìn)展，比如探討甲基化與腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及尋找診斷腫瘤的DNA甲基化標(biāo)志物，就對(duì)甲基化檢測(cè)方法提出了更高的要求。自上世紀(jì)九十年代明確提出亞硫酸氫鹽修飾DNA為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法后，甲基化檢測(cè)方法學(xué)有了關(guān)鍵性的突破。本課題的思路就是在此基礎(chǔ)上改進(jìn)現(xiàn)有的甲基化檢測(cè)方法，為我們尋找DNA甲基化腫瘤標(biāo)志物服務(wù)，并且形成一套尋找DNA甲基化腫瘤標(biāo)志物的有效模式。 本課題首先是在傳統(tǒng)亞硫酸氫鹽修飾DNA方法的基礎(chǔ)上，建立了一種

3、快速DNA修飾方法，使經(jīng)典的傳統(tǒng)方法需要一天時(shí)間來完成的DNA修飾縮減至2小時(shí)完成。通過改進(jìn)和優(yōu)化修飾的條件：用液態(tài)的亞硫酸氫銨替代亞硫酸氫鈉而加大亞硫酸氫鹽的濃度，同時(shí)提高修飾的溫度，進(jìn)而縮短修飾時(shí)間。另外，在純化回收DNA的過程中，我們用廉價(jià)的玻璃奶(液態(tài)SiO<,2>)吸附DNA，取代了過柱脫鹽純化的繁瑣操作，并且無需無水乙醇冷凍沉淀DNA，只用簡(jiǎn)單的離心就可以得到我們所需要的修飾模板，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求比較低，既方便了實(shí)驗(yàn)操作，又

4、節(jié)省了成本，利于基礎(chǔ)研究和臨床推廣使用。同時(shí)我們又對(duì)快速DNA修飾方法的修飾效果進(jìn)行了系統(tǒng)的比較和評(píng)價(jià)，我們采用的比較標(biāo)準(zhǔn)是DNA序列中除去CpG位點(diǎn)外的那些C→T的轉(zhuǎn)化效率，通過用傳統(tǒng)、快速、試劑盒三種修飾方法對(duì)正常人基因組DNA和白血病細(xì)胞株HL-60基因組DNA進(jìn)行修飾，選取DAP-K和MAGE-A3兩個(gè)基因一定長(zhǎng)度的目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物克隆測(cè)序，經(jīng)過比對(duì)序列和計(jì)算，對(duì)修飾的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行比較和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種方法沒有統(tǒng)計(jì)

5、學(xué)差異，這說明了我們的快速DNA修飾方法具有可行性。并且與傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽修飾DNA方法相比較，該方法具有快速、操作簡(jiǎn)便、實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)，可以作為亞硫酸氫鹽修飾DNA甲基化檢測(cè)方法的基礎(chǔ)。 具備了方法學(xué)的基礎(chǔ)之后，本課題的第二部分開展了尋找腫瘤DNA甲基化診斷標(biāo)志物的工作，我們把研究對(duì)象選定在種類與亞型眾多并在我國(guó)常見的白血病的甲基化診斷標(biāo)志物上。本課題該部分內(nèi)容對(duì)正常對(duì)照WBC細(xì)胞和HL-60、Jurkat及U937等三種不同類型

6、的白血病細(xì)胞株，用BSP方法，全長(zhǎng)克隆測(cè)序P73和DAP-K這兩個(gè)常見白血病抑癌基因的CpG島區(qū)域。根據(jù)各BSP產(chǎn)物的多個(gè)克隆測(cè)序結(jié)果，分析出各型細(xì)胞基因組這兩個(gè)基因的甲基化狀態(tài)。經(jīng)過分析，可以看到各細(xì)胞基因組特定甲基化模式，找到一系列各型白血病細(xì)胞株特異性甲基化改變位點(diǎn)。選擇出了可以作為區(qū)分這四種類型細(xì)胞的特異性DNA甲基化位點(diǎn)組合，作為篩選DNA甲基化腫瘤標(biāo)志物的基礎(chǔ)，并應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)方法，通過檢測(cè)臨床標(biāo)本驗(yàn)證DN

7、A甲基化模式作為腫瘤標(biāo)志物的效能。得到的結(jié)果是：用p73的MSP甲基化檢測(cè)來區(qū)分白血病標(biāo)本和正常對(duì)照時(shí)其診斷白血病的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度分別是20.8﹪、100﹪和44.1﹪，用DAP-K的MSP甲基化檢測(cè)來區(qū)分急性非淋巴細(xì)胞性白血病與急性淋巴細(xì)胞性白血病時(shí)，其診斷為急非淋白血病的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確性分別是58.5﹪、100﹪和76.4﹪。雖然得到的結(jié)果與發(fā)展成為具有臨床實(shí)用價(jià)值的DNA甲基化標(biāo)志物有一定差距，但是這使我們摸索出一套