DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達與輻射劑量關(guān)系的研究——基于納米生物探針DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白檢測方法的建立.pdf

1、準確快速測定人員吸收劑量在放射傷員的分類診斷和臨床治療、腫瘤患者的精準化和人性化放射治療、放射生物學效應(yīng)研究、特殊輻射環(huán)境人員健康危害評價等領(lǐng)域都有重要作用和意義，是當今放射醫(yī)學和輻射防護學研究的一項重要內(nèi)容。
　　 物理方法測定輻射場劑量和個體的吸收劑量直接而準確，具有權(quán)威性。但在未佩帶個人劑量計和未安裝現(xiàn)場劑量監(jiān)測計等情況下，用物理方法檢測劑量十分艱難，這不僅因為準確檢測需要花大量時間重建輻射現(xiàn)場，更因為有時輻射現(xiàn)場根本無法

2、模擬和重建。因此，在一些特殊或突發(fā)情況，用物理方法檢測人員受照劑量很難做到。
　　 用生物分析的方法來評估人員受照劑量雖有許多優(yōu)勢，是未來發(fā)展的方向，但仍存在許多待解決的科學和技術(shù)問題，問題的關(guān)鍵在于如何篩選出敏感、特異能反映生物受照劑量的一系列生物指標，及在此基礎(chǔ)上建立準確可靠、靈敏快速的分析方法技術(shù)。隨著新理論、新方法和新技術(shù)的運用，一些在基因和蛋白水平具有發(fā)展?jié)摿Φ男律飫┝繕酥疚锊粩啾话l(fā)現(xiàn)和報道。以ATM蛋白為代表的DN

3、A損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的含量和活化程度的改變與輻射劑量間的量效關(guān)系就是目前研究的熱點之一。ATM(Ataxia Telangiectasia Mutated)是一種在感應(yīng)和傳遞DNA損傷信號、啟動損傷DNA修復(fù)中起著重要作用的蛋白，其活化程度與DNA損傷程度存在依賴關(guān)系，當發(fā)生DNA損傷時，ATM蛋白自身被磷酸化，同時激活并調(diào)節(jié)一系列與DNA修復(fù)相關(guān)的蛋白，包括H2AX，RAD50，NBS1，Mre11，CHk1、2，c-AB1等，導(dǎo)致這些

4、重要功能蛋白聚集在DNA損傷和斷裂的部位，實現(xiàn)與DNA損傷部位的連接，使修復(fù)順利進行。文獻報道0.25Gy照射后30分鐘即可見ATM蛋白的活化信號，4Gy照射后3小時仍可檢測到較高強度的ATM蛋白活化熒光灶(foci)。然而，過去檢測ATM活化大都采用免疫熒光的方法直接對細胞內(nèi)的蛋白進行染色分析，此方法雖直觀，但需要通過大量細胞觀察并對其熒光強度進行識別和統(tǒng)計才能對ATM活化量進行半定量檢測，這種方法難以實現(xiàn)對輻射劑量的準確快速定量分析

5、，尤其是在低照射劑量范圍蛋白活化信號較弱的場合。因此，針對ATM等蛋白檢測在生物劑量計研究中的應(yīng)用，需要一種能直接定量和靈敏特異的檢測方法。生物傳感器是近年來發(fā)展較快的一種特異、靈敏的生物分子檢測技術(shù)，納米材料因其良好的生物相容性和獨特的光學性質(zhì)，已經(jīng)在DNA傳感器等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
　　 本研究以化學或生物修飾的納米材料為載體，以醛基磁珠表面修飾的ATM單抗捕獲樣品中的ATM抗原，通過在反應(yīng)體系中加入ATM多抗形成單抗-抗原

6、一多抗的夾心結(jié)構(gòu)，通過納米生物探針實現(xiàn)信號放大輸出，建立可對溶質(zhì)中fg量級ATM蛋白進行靈敏、特異檢測的方法，實現(xiàn)對目標蛋白的靈敏、特異檢測。與傳統(tǒng)方法比，這種檢測方案有可能使受評估的劑量范圍更低。由于不同探針設(shè)計實現(xiàn)檢測的方法不同，各有利弊，本研究在對一系列納米生物探針，如IgG-納米金-DNA探針，IgG-納米金-HRP探針，摸索篩選的基礎(chǔ)上尋找史簡便易行、穩(wěn)定可靠的檢測策略-IgG-納米碳管-HRP探針。
　　 研究內(nèi)容<

7、br>　　 根據(jù)篩選探針的不同，主要研究內(nèi)容分為三部分：
　　 一、基于IgG-納米金-HRP探針的方法檢測ATM蛋白
　　 二、基于IgG-納米碳管-HRP探針的方法檢測ATM蛋白
　　 三、基于IgG-納米金-DNA探針的RCA方法
　　 研究步驟
　　 一、納米金和納米碳管探針的制備
　　 分別調(diào)節(jié)納米金溶液的PH致所加蛋白的等電點附近和將納米碳管表面的羧基用EDC和NHS活化，將

8、0.005mg/ml的IgG和1mg/ml的HRP分別加入到準備好的納米金或納米碳管中，室溫反應(yīng)過夜，BSA封閉，離心洗滌去掉未結(jié)合反應(yīng)的蛋白，用儲存液(0.5％casein)重懸沉淀即為納米探針。
　　 二、制備探針的驗證
　　 在包被有ATM蛋白的多克隆抗體的醛基磁珠體系中加入制備的探針，通過檢測探針上的二抗和磁珠上的多抗是否發(fā)生特異性顯色反應(yīng)，驗證探針表面兩種蛋白連接的成敗和生物活性。
　　 三、利用探針檢

9、測目標蛋白
　　 將ATM單克隆抗體加入到醛基化磁珠中，25℃下孵育1h，洗滌除去游離蛋白，加入封閉液37℃反應(yīng)1h，封閉醛基磁珠表面可能存在的空白活性位點。封閉結(jié)束后，PBST(150mMPBS,0.25％Tween20)洗滌3min×2次，加入ATM抗原溶液至蛋白標記的磁珠溶液中，37℃輕微振蕩反應(yīng)1h。PBST洗滌3min×2次，然后各加入ATM多克隆抗體，37℃下輕微振蕩反應(yīng)1h。PBST洗滌3min×2次，加入制備好的

10、探針溶液，37℃下再次孵育1h，實現(xiàn)抗原抗體的免疫反應(yīng)連接。結(jié)束后，PBST洗滌3min×4次，加入TMB(含H2O2)室溫孵育2～3min，變色完全并穩(wěn)定后，酶標儀測光吸收值，收集數(shù)據(jù)并分析。
　　 四、數(shù)據(jù)處理
　　 用SPSS11.0分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，一維方差分析法進行顯著性檢驗(以P＜0.05為差異顯著)。利用origi8.0制作各圖表。方法檢測限的確定標準為將陰性對照均值加上三倍陰性對照的標準偏差設(shè)為閾

11、值，信號高于此值的濃度即為該方法的最低檢測限。方法的特異性從實驗組與陰性對照組信號差別的量級上體現(xiàn)。
　　 本研究的初步結(jié)果：
　　 制備出IgG-納米金-DNA探針，IgG-納米金-HRP探針和IgG-納米碳管-HRP探針三種具有生物活性的納米生物探針，經(jīng)比較分析納米碳管生物探針基本能滿足標準體系中對ATM蛋白特異、靈敏和可重復(fù)性的檢測。
　　 初步結(jié)論：
　　 與檢測蛋白的經(jīng)典ELISA方法和其他生物