各類生物制品的分離純化方法

1、,,復(fù)習(xí)：生物制品：生物制品系指以微生物、寄生蟲、動(dòng)物毒素、生物組織作為起始材料，采用生物學(xué)工藝或分離純化技術(shù)制備，并以生物學(xué)技術(shù)和分析技術(shù)控制中間產(chǎn)物和成品質(zhì)量制成的生物活性制劑。包括疫（菌）苗、毒素、類毒素、免疫血清、血液制品、免疫球膽白、抗原、變態(tài)反應(yīng)原、細(xì)胞因子、激素、酶、發(fā)酵產(chǎn)品、單克隆抗體、DNA重組產(chǎn)品、體外免疫診斷試劑等，供某些疾病的預(yù)防、治療和診斷用。,,,第二節(jié) 各類生物制品的分離純化方法,,,一、蛋白質(zhì)類制品的

2、分離純化方法二、核酸類制品的分離純化方法三、糖類制品的分離 純化方法四、脂類制品的分離純化五、氨基酸類制品的分離純化,,一、蛋白質(zhì)類制品的分離純化,,概述蛋白質(zhì)（protein）是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。因此，它是與生命及與各種形式的生命活動(dòng)緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)。機(jī)體中的每一個(gè)細(xì)胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)參與。蛋白質(zhì)占人體重量的16.3%，即一個(gè)60kg重的成年人其體內(nèi)約有蛋白質(zhì)9.8kg。人體內(nèi)蛋白質(zhì)的種類

3、很多，性質(zhì)、功能各異，但都是由20多種氨基酸按不同比例組合而成的，并在體內(nèi)不斷進(jìn)行代謝與更新。,蛋白質(zhì)的存在,廣泛存在于生物體內(nèi)：肌肉、皮膚、發(fā)、毛、蹄、角,——主要成分都是蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)是組成細(xì)胞的基礎(chǔ)物質(zhì)構(gòu)成人體的物質(zhì)基礎(chǔ),植物種子、酶、激素、血紅蛋白、細(xì)菌、病毒、抗體 ——都含蛋白質(zhì),,,,1.根據(jù)分子形狀和大小不同進(jìn)行分離：如離心、超濾2.根據(jù)分子電

4、離性質(zhì)（即帶電性）的差異進(jìn)行分離：如離子交換法、等電點(diǎn)沉淀法（即酸沉、堿沉）,（一）分離純化蛋白質(zhì)的主要原理是：,,,,3.根據(jù)分子極性大小及溶解度不同進(jìn)行分離：如有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法（即醇沉）、鹽析法。4.根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)的不同進(jìn)行分離：如吸附層析法。5.根據(jù)配體特異性進(jìn)行分離：如親和層析。,,,（二）分離純化常用方法,1.有機(jī)溶劑沉淀法（醇沉）：原理：在溶液中，生物大分子自身所帶的電荷能與水相互作用，在大分子表面形成水化膜，保證

5、了生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性。但在水溶液中加入有機(jī)溶劑（如乙醇）后，有機(jī)溶劑會(huì)破壞大分子表面的水化膜，另外，加入有機(jī)溶劑會(huì)使溶液的極性減小，生物大分子在溶液中的溶解度就會(huì)降低，從而產(chǎn)生沉淀，這樣目的物就從水溶液中沉淀而分離了出來。,,,有機(jī)溶劑的選擇：有機(jī)溶劑沉淀法常用的有機(jī)溶劑為乙醇，因?yàn)橐掖荚谒械娜芙舛却?，毒性小，操作方便。用乙醇去沉淀生物大分子就是我們常說的醇沉。 例如應(yīng)用乙醇分離血漿蛋白，控制乙醇濃度在8%時(shí)得

6、到血纖蛋白原，乙醇濃度在25%時(shí)得到丙種球蛋白，乙醇濃度在40%時(shí)得到α、β球蛋白。,,,2.等電點(diǎn)沉淀法（酸沉、堿沉）,原理：多數(shù)的生物活性物質(zhì)都是帶電物質(zhì)，都有自己的等電點(diǎn)，這些帶電基團(tuán)所帶電荷的數(shù)量與PH密切相關(guān)。當(dāng)溶液的PH大于生物大分子的等電點(diǎn)時(shí)，該物質(zhì)帶負(fù)電荷；當(dāng)溶液的PH小于物質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，該物質(zhì)帶正電荷，當(dāng)溶液的PH等于物質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，該物質(zhì)的凈電荷為零，此時(shí)的生物大分子溶解度最低，會(huì)聚集到一起形成沉淀而從溶液中析出。,

7、,,方法：溶液的PH達(dá)到目的物的等電點(diǎn)時(shí)，目的物就會(huì)沉淀分離，所以向含有生物活性成分的溶液中加入酸或堿，來調(diào)節(jié)溶液的PH，使溶液的酸堿度達(dá)到工藝要求，就能使目的物沉淀而分離出來。這就是平時(shí)常說的酸沉與堿沉。,,,3.離心分離法,在固相和液相混合體系中，要把兩相分離開來，通常有兩種方法，一種是過濾，一種是離心。離心是分離技術(shù)中最常用的方法之一，它對(duì)于固體顆粒小，溶液粘度大的溶液以及細(xì)胞培養(yǎng)液或生物材料的大分子抽提液是十分有效的，尤其是對(duì)于

8、用一般過濾難以奏效的物質(zhì)，采用離心技術(shù)可達(dá)到分離的目的。尤其是高速和超速冷凍離心機(jī)的相繼問世，離心已成為生化、生物工程、生物制藥的分離純化的重要方法。,,,原理：離心分離時(shí)的樣品物質(zhì)通常是懸浮在某一特定的液相介質(zhì)中，由此而形成的固液懸浮體系，將該體系放入離心機(jī)的離心管內(nèi)，開機(jī)后樣品物質(zhì)做勻速圓周運(yùn)動(dòng)，于是就產(chǎn)生了一個(gè)外向離心力。而由于不同顆粒的質(zhì)量、密度、大小不同，在同一液相介質(zhì)和相同的離心力場(chǎng)下，沉降速度各不相同，顆粒由大到小沉淀，這

9、樣就會(huì)產(chǎn)生分層，從而達(dá)到彼此分離。,,,離心機(jī)類型普通離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不超過6000轉(zhuǎn)/每分鐘高速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為25000轉(zhuǎn)/每分鐘超速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為25000轉(zhuǎn)/每分鐘以上。,,,4.超濾分離法,原理：超濾分離法是以壓力為推動(dòng)力的膜分離法的一種，原理是根據(jù)被分離物質(zhì)的分子顆粒大小，選擇孔徑不同的半透膜。使一定大小的分子透過，而阻礙另一種物質(zhì)或分子量較大的物質(zhì)透過。此法的實(shí)質(zhì)是各種物質(zhì)的分子大小不同，能通過的半透膜的孔徑也就

10、不同，從而能夠分離。,,,超濾是分離生物活性物質(zhì)常用的方法，此外還有透析法、反滲透法等，都是利用各種半透膜的選擇透過性進(jìn)行分離的技術(shù)。,,,超濾裝置，有板式、管式、卷式、中空纖維式等形式。,中空纖維式,,,其他常用的分離純化生化物質(zhì)的方法：5.鹽析法6.親和層析法7.吸附法8.電泳法,,二、核酸類制品的分離純化,,核酸是重要的生物大分子化合物，所有的有機(jī)體中都含有核酸。核酸占有機(jī)體細(xì)胞干重的5％～15％。 核酸是生物體遺

11、傳和變異的物質(zhì)基礎(chǔ)。對(duì)遺傳物質(zhì)DNA、RNA的研究，尤其是利用DNA重組技術(shù)進(jìn)行的基因工程的研究一直是生物工程中的熱點(diǎn)和重點(diǎn)問題。,,,核酸是由核苷酸組成的具有復(fù)雜三維空間結(jié)構(gòu)的大分子化合物，是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。核酸分為兩類，一類是脫氧核糖核酸（DNA），主要存在于細(xì)胞核的染色質(zhì)中，另一類是核糖核酸（RNA）主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。RNA按結(jié)構(gòu)和功能不同又可分為三類：核糖體RNA，信使RNA和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA。,概述,,,,核酸類藥物可分為兩大類

12、：一類是具有天然結(jié)構(gòu)的核酸類藥物，這類物質(zhì)有助于改善機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量平衡，修復(fù)受損傷的組織，所以這類藥物已廣泛用于放射病、血小板減少癥，白細(xì)胞減少癥、急慢性肝炎和肌肉萎縮等疾病。,,另一類核酸類藥物為天然核酸的類似物或衍生物，這類藥物具有干擾腫瘤、干擾病毒代謝的功能，因此在治療病毒性皰疹、艾滋病、腫瘤方面有一定的療效。,,1.RNA的提取與分離,（1）材料的選擇：制備RNA的材料大多選取動(dòng)物的肝、腎、脾等核酸量豐富的組織。工業(yè)生產(chǎn)

13、上主要用啤酒酵母、面包酵母等真菌的菌體為原料。,,,（2）提取A:乙醇沉淀法:將核糖核蛋白溶于碳酸氫鈉溶液中，然后加入少量辛醇的氯仿溶液，并連續(xù)震蕩，以沉淀除去蛋白質(zhì)雜質(zhì)。去沉淀留上清液，加入規(guī)定量乙醇使RNA沉淀析出即得。B:去污劑處理法：在核糖核蛋白溶液中加入去污劑，使蛋白質(zhì)沉淀，過濾得上清液，再加乙醇使RNA沉淀。常用的去污劑有SDS（十二烷基磺酸鈉）、氯仿等。,,3.RNA藥物的用途：用于精神遲緩、記憶衰退。,,2.DN

14、A的提取與分離,（1）材料的選擇：制備DNA的材料一般用小牛胸腺或魚精，這類組織的細(xì)胞體積較小，如魚精，整個(gè)細(xì)胞幾乎全部被細(xì)胞核所占據(jù)，細(xì)胞質(zhì)的含量極少故這類組織的DNA含量較高。,,,（2）提取將含有DNA的沉淀物用0.14mol/L的氯化鈉溶液反復(fù)洗滌，盡量除去RNA，然后用生理鹽水溶解沉淀物，并加入到去污劑SDS溶液中使DNA與蛋白質(zhì)解離、變性。冷藏過夜，再加入氯化鈉使DNA溶解，過濾取上清液，加入乙醇使DNA析出，反復(fù)幾次可得

15、到高純度DNA.,,3.DNA藥物的用途：有抗放射作用。,,三、糖類藥物的分離純化,,糖的分類：,按分子組成可分為,單糖,雙糖,多糖,葡萄糖、果糖,乳糖、蔗糖、麥芽糖,淀粉、纖維素、糖原,,,,,（一）單糖及其衍生物的制備,1.提?。?jiǎn)翁且兹苡诶渌蜏匾掖贾?，可用水?0%乙醇提取，2.提純：用醋酸鉛鹽析除去蛋白質(zhì)雜質(zhì)。,（二）多糖的分離與純化,1.提?。海?）難溶于水、可溶于稀堿液者：堿提醇沉。（2）易溶于溫水、難溶于冷水和