艾滋病抗體檢測技術(shù)免疫印跡法及質(zhì)量控制黎俊宏

1、艾滋病抗體檢測技術(shù)（免疫印跡法）及質(zhì)量控制,黎俊宏檢測檢驗(yàn)中心艾滋病確證實(shí)驗(yàn)室,常州市疾病預(yù)防控制中心,Changzhou Center for Disease Control and Prevention,全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范（2015年修訂版）第六章 艾滋病病毒感染實(shí)驗(yàn)室檢測策略,,我國自上世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)第一例艾滋病病例至今，各地市艾滋病感染者呈逐年增長趨勢。 4 臨床診斷相關(guān)的檢測策略及結(jié)果報(bào)告

2、 4.1 使用抗體檢測試劑的檢測流程：,,4.3 補(bǔ)充試驗(yàn)檢測策略補(bǔ)充試驗(yàn)分為抗體確證試驗(yàn)和HIV-1核酸試驗(yàn)?？贵w確證試驗(yàn)包括免疫印跡試劑（WB）和條帶/線性免疫試驗(yàn)（RIBA/LIA）， 特定條件下的替代檢測（三種酶聯(lián)免疫試驗(yàn)、三種快速試驗(yàn)或者酶聯(lián)免疫加快速試驗(yàn)），免疫層析或免疫滲濾試驗(yàn)。HIV-1核酸試驗(yàn)包括定性和定量試驗(yàn)。,*兩種試劑可以是原有試劑加另一種試劑， 也可以是兩種不同試劑。,全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范（2

3、015年修訂版）第六章 艾滋病病毒感染實(shí)驗(yàn)室檢測策略,,全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范（2015年修訂版）第六章 艾滋病病毒感染實(shí)驗(yàn)室檢測策略,HIV確證試驗(yàn)的方法,,,,,,,2,,,3,,,1,,,4,LIA 條帶免疫試驗(yàn),RIPA 放射免疫沉淀試驗(yàn),IFA 免疫熒光試驗(yàn),WB 免疫印跡試驗(yàn),HIV抗體WB試驗(yàn)具有很高的敏感性和特異性，是國內(nèi)HIV抗體確證的金標(biāo)準(zhǔn)。,RIBA/LIA 條線/線性免疫試驗(yàn),,West

4、ern Blot與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳 ，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影

5、以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。,WB的原理,,,WB檢測HIV抗體的原理,硝酸纖維試劑膜條上結(jié)合了天然滅活的HIV-1型病毒蛋白的分離顆粒和特異性的HIV-2型合成多肽。在膜條分別加入稀釋的血清或血漿樣本或?qū)φ?，孵育。如果樣本中含有HIV-1和HIV-2型的特異性抗體，則抗體會(huì)與試劑膜條上的HIV-1蛋白和HIV-2多肽結(jié)合，通過清洗去除試劑膜條上的未結(jié)合物，與HIV蛋白特異性結(jié)合的抗體再通過與帶有堿性磷酸酶的羊抗人Ig

6、G抗體結(jié)合，加入BCIP/NBT底物等一系列反應(yīng)即可顯色。,全病毒裂解液電泳得到的膜條,,,在HIV顆粒中，外膜蛋白（env）基因編碼的一個(gè)蛋白經(jīng)糖基化后形成包膜蛋白前體（gp160），其在蛋白酶作用下裂解成外膜蛋白（gp120）和跨膜蛋白（gp41）；核心蛋白（gag）基因編碼的前體蛋白（p55）被蛋白酶裂解為衣殼蛋白（p24）和內(nèi)膜蛋白（p17），p39為p55的碎片；逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白（pol）基因編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶（p66、p51）和核酸

7、內(nèi)切酶（p31），而機(jī)體對上述HIV蛋白產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，又在WB中出現(xiàn)相應(yīng)的不同組合的帶型。 這既是確證HIV抗體陽性的條件，又能作為HIV感染期和AIDS期的參考依據(jù)。,,HIV模型圖,脂雙層膜,gp120,gp41,包膜糖蛋白,p24衣殼蛋白,p17內(nèi)膜蛋白,p7核衣殼蛋白,逆轉(zhuǎn)錄酶,蛋白酶,整合酶,,,,,,,,,,,,,,,env編碼 外膜蛋白gp120 跨膜蛋白gp41（包膜蛋白前體gp160為gp

8、41聚合體）,,,?,env基因的結(jié)構(gòu)及env蛋白,gag基因的結(jié)構(gòu)及gag蛋白功能,gag基因編碼病毒核心蛋白 前體蛋白p55（p39為p55的碎片）、衣殼蛋白p24、內(nèi)膜蛋白p17,,,?,pol基因的結(jié)構(gòu)及pol蛋白,pol基因編碼的酶類p66和p51蛋白為逆轉(zhuǎn)錄酶p32蛋白則為整合酶P11蛋白為蛋白酶,,?,,嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP),確證試驗(yàn)的要點(diǎn),嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,嚴(yán)格控制防止樣品間的交

9、叉污染,,試劑,MP生物醫(yī)學(xué)亞太私人有限公司（MP）HIV-1/2混合型試劑（MP HIV BLOT 2.2）上海英旻泰生物技術(shù)有限公司（IMT）HIV-1/2混合型試劑（IMT HIV-1/2 Blot）,實(shí)驗(yàn)藍(lán)圖,實(shí)驗(yàn)原始記錄,,結(jié)果的判定,首先要確定可見到標(biāo)本質(zhì)控帶.如果標(biāo)本質(zhì)控帶是陰性,則檢測無效;因?yàn)檫@表示技術(shù)上有錯(cuò)誤,如未加樣本,酶結(jié)合物或底物液。與強(qiáng)和/或弱陽性對照試劑膜對照,確定檢測試劑膜上每一條帶的分子

10、量。按照試劑盒說明書判定標(biāo)準(zhǔn)，判斷待測樣品為陽性、陰性或不確定。,,HIV-1抗體陽性 檢測出2條env帶（gp160/gp41和gp120）及gag（p17，p24，p55）或pol（p31，p51，p66）HIV抗體陰性 沒有病毒的特異性條帶或只檢測出p17抗體HIV抗體不確定 出現(xiàn)任何病毒特異條帶，但不足以判斷為陽性,試劑盒說明書,,技術(shù)規(guī)范（2009版）,HIV-1抗體

11、陽性 至少有2條env帶（gp41和gp160/gp120）出現(xiàn)，或至少1條env帶和p24帶同時(shí)出現(xiàn)。HIV抗體陰性 無HIV抗體特異帶出現(xiàn)。HIV抗體不確定 出現(xiàn)HIV抗體特異帶，但不足以判定陽性。HIV-2抗體血清學(xué)陽性出現(xiàn)HIV-2型特異性指示帶的樣品：如果同時(shí)呈HIV-1 抗體陽性反應(yīng)，只需報(bào)告HIV-1 抗體陽性，不推薦進(jìn)一步做HIV-2 抗體確證試驗(yàn)；如果同時(shí)呈HIV-

12、1抗體不確定或陰性反應(yīng)，需用HIV-2型確證試劑再做HIV-2的抗體確證試驗(yàn)。同時(shí)符合以下二條標(biāo)準(zhǔn)，即出現(xiàn)至少2條env 帶（gp36和gp140/ gp105），和試劑盒提供的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，可判為HIV-2抗體陽性。,,HIV基因組,ENV區(qū) gp160:gp41的聚合體 寬的擴(kuò)散糖蛋白帶 gp120:外膜蛋白 擴(kuò)散糖蛋白帶 gp41:跨膜蛋白 擴(kuò)散糖蛋白帶POL區(qū)

13、 p66:逆轉(zhuǎn)錄酶 細(xì)窄條帶 p51:逆轉(zhuǎn)錄酶 細(xì)窄條帶 p31:核酸內(nèi)切酶 雙重條帶GAG區(qū) p55:前體蛋白 細(xì)窄條帶 p39:p55的碎片 細(xì)窄條帶 p24:核心蛋白 寬闊條帶 p17:核心蛋白 寬闊條帶,條帶,確證陽性,

14、首次確證不確定,孕婦第一次確證,MSM第一次確證,再次確證陰性,孕婦4周后隨訪確證結(jié)果,MSM4周后隨訪確證結(jié)果,From不確定to陽性,送檢時(shí)間：2011年1月送檢時(shí)間：2011年2月,,質(zhì)量控制,第二章 HIV抗體檢測,7 質(zhì)量控制 7.1 酶免或發(fā)光法抗體檢測的室內(nèi)質(zhì)量控制7.2 快速法抗體檢測質(zhì)控,WB法HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)質(zhì)控,7.1 酶免或發(fā)光法抗體檢測的室內(nèi)質(zhì)量控制7.1.1 試劑盒內(nèi)部對照

15、7.1.2 室內(nèi)質(zhì)控品7.1.3 Levey-Jennings質(zhì)控圖7.1.4 室內(nèi)質(zhì)控其他方式—“即刻法”質(zhì)控,試劑盒內(nèi)提供的陽性和陰性對照：判斷每次實(shí)驗(yàn)的有效性，不能作為室內(nèi)質(zhì)控品使用；每次須有，且只能同批號(hào)試劑盒用；如無效，須重做。,非試劑盒組份的外部質(zhì)控品：監(jiān)控檢測的重復(fù)性，且須為弱陽性；判斷該批臨床樣品檢測的可信性；每次須有；失控須重做?？少I或自制：穩(wěn)定、無菌、不含影響試劑反應(yīng)的防腐劑。,第二章 HIV抗體檢測,

16、7.1.3 Levey-Jennings質(zhì)控圖,7.1.3.1 質(zhì)控圖參數(shù) 外部質(zhì)控品的均值和標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)建立在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用方法對外部質(zhì)控品重復(fù)測定的基礎(chǔ)上。一般采用在不同批次檢測取得至少20個(gè)數(shù)據(jù)；如果僅做少量批次的檢測，也至少做5個(gè)批次的檢測，每個(gè)批次中不少于4個(gè)質(zhì)控血清測定結(jié)果，以建立一個(gè)臨時(shí)性的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，當(dāng)達(dá)到20批次數(shù)據(jù)后，替代臨時(shí)性的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。 （1）算術(shù)平均值（ ）：代表一組質(zhì)控品測定S/CO值

17、的均值。為了統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義，應(yīng)該采用至少20次（天）測得的外部對照質(zhì)控品的S/CO值計(jì)算平均值。 （2）標(biāo)準(zhǔn)差（s）：是描述樣品與均數(shù)之間離散程度的一個(gè)指標(biāo)，是與質(zhì)控品S/CO值均值有關(guān)的預(yù)期范圍。一組S/CO值的標(biāo)準(zhǔn)差以s表示。 （3）變異系數(shù)（cv）：是反映各次S/CO值相對于均值離散程度的一個(gè)指標(biāo)，可以用來衡量檢測的重復(fù)性或精密度。 （4）控制限：由實(shí)驗(yàn)室根據(jù)對外部質(zhì)控品檢測結(jié)果的均值和標(biāo)準(zhǔn)差來確定。例如，

18、按照12S質(zhì)控規(guī)則，控制限為外部質(zhì)控品S/CO均值加減2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差；按照13S質(zhì)控規(guī)則，控制限為外部質(zhì)控品S/CO均值加減3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。,7.1.3 Levey-Jennings質(zhì)控圖,7.1.3.2 質(zhì)控規(guī)則 實(shí)驗(yàn)室在報(bào)告結(jié)果之前必須評價(jià)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，可通過圖形記錄的檢查或由計(jì)算機(jī)審核結(jié)果來決定。目前有許多質(zhì)控規(guī)則，常用的是12S和13S規(guī)則。（1）告警（12S）：當(dāng)外部質(zhì)控品的S/CO值超出 +2s范圍時(shí)，系統(tǒng)處于告警狀態(tài)

19、，應(yīng)予注意，是否可以繼續(xù)檢測需要進(jìn)一步觀察。若將12S做失控標(biāo)準(zhǔn)，有較高的假失控概率，所以一般不采用。（2）失控（13S）：當(dāng)外部質(zhì)控品的S/CO值超出 +3s范圍時(shí)，系統(tǒng)處于失控狀態(tài)，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能被接受，可能是系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差或外部質(zhì)控品 穩(wěn)定性下降所致。7.1.3.3 質(zhì)控圖的分析及失控處理 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立質(zhì)控圖分析及失控情況處理的程序。當(dāng)出現(xiàn)失控時(shí)，必須找出發(fā)生問題的原因，找出解除問題的方法，并消除原因。,外部

20、質(zhì)控品？實(shí)驗(yàn)操作？不同人員？儀器？（如加樣槍？洗板機(jī)堵孔？酶標(biāo)儀未每年校準(zhǔn)？）繪制質(zhì)控圖錯(cuò)誤？……,7.1.4 室內(nèi)質(zhì)控其他方式—“即刻法”質(zhì)控,7.1.4 室內(nèi)質(zhì)控其他方式—“即刻法”質(zhì)控,（1）當(dāng)SI上限和SI下限 n3s值時(shí)說明該值已在3s范圍之外，屬“失控”?！凹纯谭ā敝荒茉谇?0次內(nèi)使用，超出即可采用L-J質(zhì)控圖方法。,第二章 HIV抗體檢測,7.2 快速法抗體檢測質(zhì)控7.2.1 試劑內(nèi)對照7.2.2 室內(nèi)

21、質(zhì)控品對照7.2.3 開展抗體相關(guān)檢測的實(shí)驗(yàn)室須參加有資質(zhì)機(jī)構(gòu)組織的能力驗(yàn)證，或室間比對。,質(zhì)控窗口內(nèi)的質(zhì)控帶，試劑自帶內(nèi)部過程質(zhì)控：實(shí)驗(yàn)操作全部完成且實(shí)驗(yàn)所用材料處于工作狀態(tài)；清潔的檢測區(qū)背景是內(nèi)部陰性過程質(zhì)控；如未有紅色質(zhì)控帶：試劑盒內(nèi)質(zhì)控?zé)o效，該結(jié)果無效，須重做。,外部質(zhì)控品可商用或自制質(zhì)控品：抗體陽性和陰性樣品；下列情況需做質(zhì)控：更換試劑批號(hào)、檢測人員、包裝、試劑廠家。除此之外，建議每個(gè)檢測日檢測一次陽性和陰性質(zhì)控品；如果日

22、檢測量大于50份樣品，至少應(yīng)作2次質(zhì)控。,出現(xiàn)以下問題，提示存在質(zhì)量隱患，應(yīng)引起重視：運(yùn)輸包裝、內(nèi)盒或試劑盒的物理損傷；在單包裝內(nèi)存在混雜物質(zhì)；標(biāo)簽出現(xiàn)錯(cuò)誤、缺失或字跡模糊 （特別是產(chǎn)品名稱或出產(chǎn)廠家名稱，批號(hào)和貨號(hào)，失效期或/和生產(chǎn)日期）；缺失目錄；泄漏或污染；不適宜的存放條件；保護(hù)包裝紙破損或污染；未達(dá)到質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn) （陽性/陰性控制結(jié)果以及質(zhì)控條帶出現(xiàn)與否等標(biāo)志）；試劑質(zhì)量問題須報(bào)告省確證中心實(shí)驗(yàn)室。,WB法HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)質(zhì)控

23、,一、室內(nèi)質(zhì)控: 儀器質(zhì)控：儀器是否運(yùn)轉(zhuǎn)正常，管路是否堵塞； 過程質(zhì)控： 1、試劑質(zhì)控，強(qiáng)陽、弱陽、陰性對照； 2、樣品質(zhì)控，有無交叉污染，相鄰的槽道是否出現(xiàn)完全一樣的條帶； 3、數(shù)據(jù)質(zhì)控，室溫25±3℃（ ＜20 ℃ 需開空調(diào)），結(jié)果判讀需兩名判讀人和一名審核人。二、外部質(zhì)控：參加有資質(zhì)機(jī)構(gòu)組織的能力驗(yàn)證，即室間比對，如全國艾滋病

24、檢測實(shí)驗(yàn)室HIV抗體血清學(xué)能力驗(yàn)證。,條帶位置,試劑批號(hào)不同甚至同一批號(hào)不同盒子，同一條帶的位置并不是相同的,,早期感染帶型？（疑似）,Gp160+p24 gp120很弱或者沒有或還有其他,,,早期感染帶型？（疑似）,,,早期感染帶型？（疑似）,,,進(jìn)展帶型？,,AIDS（晚）期帶型？,ENV帶強(qiáng)度保持恒定，p24缺失或強(qiáng)度明顯降低,AIDS（晚）期帶型？,,,第二章 HIV抗體檢測6.2 確證報(bào)告6.2.1 WB及 RIBA

25、/LIA報(bào)告,,,,,,急性期,,無癥狀期,窗口期,HIV抗原、抗體變化圖,,Anti-P24,Anti-gp41/120(anti-gp36),HIV RNA,Anti-Ag,,,1周 2周…..1月 2月………………….1年 2年 3年…………….10年………..,,艾滋病期,Anti-Ab,,,獻(xiàn)血員中一例陽性,送檢時(shí)間：2010年12月,備注：9.13獻(xiàn)血，酶免陰性，核酸陽性。12.18檢測，酶免陽性，核

26、酸陽性。建議仔細(xì)詢問發(fā)生高危行為的時(shí)間。,工欲善其事必先利其器,加樣器的使用,準(zhǔn)備,設(shè)定移液量,安裝吸頭,,按壓至第一停點(diǎn)位置,吸液,貼壁,輕輕按壓放液,貼壁,按壓至第一停點(diǎn)后，再按壓第二停點(diǎn)，排盡吸頭殘余液體,松開按鈕，彈回至原來的位置,按壓吸頭推頂，退除吸頭,加樣器的使用,正向加樣法,反向加樣法,加樣器-注意事項(xiàng),根據(jù)所需取液量選擇相應(yīng)的移液器及吸頭，使用帶濾芯的吸頭，可防止交叉污染。,日本W(wǎng)ATSON ：低吸附、高精度、無RN

27、A酶、無DNA酶、無熱源、加長吸頭 、帶濾芯已消毒,,吸取液體時(shí)應(yīng)緩慢勻速吸取，避免液體濺到移液器頭上；打出液體后拇指不應(yīng)松開按鈕，將吸液嘴壓掉后再將拇指松開，避免液體回吸。在調(diào)整取液量的旋鈕時(shí)，不要用力過猛，并應(yīng)注意計(jì)數(shù)器顯示的數(shù)值不要超過其可調(diào)范圍。連續(xù)可調(diào)式移液器不可在無吸頭時(shí)使用，吸頭有液體時(shí)不可平放或倒置。,加樣器-注意事項(xiàng),,操作時(shí)要慢和穩(wěn)，吸嘴浸入液體深度要合適，吸液過程盡量保持不變；改吸不同液體、樣品或試劑前

28、要換新吸嘴；發(fā)現(xiàn)吸嘴內(nèi)有殘液時(shí)必須更換；新吸嘴使用前應(yīng)先預(yù)測。為防止液體進(jìn)入移液器套筒內(nèi)，注意以下幾點(diǎn)：壓放按鈕時(shí)保持平穩(wěn)；移液器不得倒轉(zhuǎn)；吸嘴中有液體時(shí)不可將移液器平放；5ML及10ML移液器一定要加濾芯。切勿用油脂等潤滑活塞或密封圈。使用了酸性或有腐蝕蒸氣的溶液后，最好拆下套筒，用蒸餾水清洗活塞及密封圈。,,加樣器-注意事項(xiàng),,連續(xù)可調(diào)式移液器在取樣加樣過程中應(yīng)注意移液嘴不能觸及其他物品，以免被污染；移液嘴盒（架子

29、）、廢液瓶、所取試劑及加樣的樣品管應(yīng)擺放合理，以方便操作過程、避免污染為原則。連續(xù)可調(diào)式移液器在使用完畢后應(yīng)置于移液器架上，遠(yuǎn)離潮濕及腐蝕性物質(zhì)。在取液之前，所取液體應(yīng)在室溫（15-25?C）平衡；液體溫度與室溫有異時(shí)，將吸嘴預(yù)洗多次再用；移液溫度不得超過70℃。,,加樣器-注意事項(xiàng),加樣器-常規(guī)維護(hù),,加樣器應(yīng)根據(jù)使用頻率進(jìn)行維護(hù)，但至少應(yīng)每3個(gè)月進(jìn)行一次，具體方法如下：1．一般維護(hù)可用中性洗滌劑（如洗餐具用的洗滌靈）

30、清潔，或者用60%的異丙醇，然后用蒸餾水反復(fù)洗滌，去除洗滌劑或異丙醇，晾干。清潔后活塞處可使用一定量的潤滑劑。2．如果有液體進(jìn)入加樣器內(nèi)的嚴(yán)重污染，可以將加樣器拆開后進(jìn)行清潔，具體拆開步驟參照加樣器說明書（不同的加樣器的拆開方式有所不同）。3．高壓消毒，有的加樣器的吸管部分可高壓消毒（121℃，20分鐘），如Eppendor的Research單道可調(diào)加樣器。但消毒時(shí)不可超溫超時(shí)，也不能擠壓放置，以免造成變型。,定期校準(zhǔn)：有資

31、質(zhì)的服務(wù)商提供校準(zhǔn)服務(wù)，并貼已校準(zhǔn)標(biāo)簽。,AIDS,confirmation laboratory,艾滋病確證實(shí)驗(yàn)室,AIDS,confirmation laboratory,艾滋病確證實(shí)驗(yàn)室,海恩法則,“每一起嚴(yán)重事故的背后，必然有29次輕微事故和300起未遂先兆以及1000起事故隱患。” ——德國人帕布斯?海恩（德國飛機(jī)渦輪機(jī)的發(fā)明者 ）,兩點(diǎn)：一是事故的發(fā)生是量的積累的結(jié)果；二是再好的技術(shù)，再完美的規(guī)章，在實(shí)際操作層面，也