第章抗生素生產(chǎn)工藝

1、第一節(jié) 抗生素的定義、命名及應(yīng)用第二節(jié) 抗生素的分類第三節(jié) 抗生素劑量表示法第四節(jié) 青霉素生產(chǎn)工藝第五節(jié) 紅霉素生產(chǎn)工藝,抗生素在目前的制藥工業(yè)中仍占有舉足輕重的地位，尤其是下游半合成抗生素的發(fā)展，進(jìn)一步刺激了上游的工業(yè)發(fā)酵。一些抗生素的工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模非常大，如β-內(nèi)酰胺類的青霉素、頭孢菌素C，大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素、利福霉素，氨基環(huán)醇類的鏈霉素、慶大霉素。其它的一些抗生素，如林可霉素、四環(huán)素、金霉素、萬古霉素等，單個發(fā)酵罐

2、容積越來越大，100m3的發(fā)酵罐被普遍采用，200m3甚至更大容積的發(fā)酵罐經(jīng)常可見報道。,抗生素的工業(yè)生產(chǎn)包括發(fā)酵和提取兩部分。工藝流程大致如下：菌種的保藏、孢子制備、種子制備、發(fā)酵、提取和精制。,種子和發(fā)酵培養(yǎng)基的常用碳源有：葡萄糖、淀粉、蔗糖、油脂、有機(jī)酸等，主要為菌體生長代謝提供能源，為合成菌體細(xì)胞和目的產(chǎn)物提供碳元素。 有機(jī)氮源多用玉米漿、黃豆餅粉、麩質(zhì)粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉等，硫酸銨、尿素、氨水、硝酸鈉、硝酸

3、銨則是常用的無機(jī)氮源。 另外，培養(yǎng)基中還得添加無機(jī)鹽、微量元素以及消沫劑，部分抗生素還得加入特殊前體，如青霉素的前體是苯乙酸，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的前體是丙酸鹽。 發(fā)酵過程普遍補(bǔ)加一種碳源、氮源物質(zhì)，如葡萄糖和硫酸銨。pH值通過流加氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)，很多抗生素在發(fā)酵中后期流加前體，對提高產(chǎn)量非常有益。 抗生素發(fā)酵絕大多數(shù)為好氧培養(yǎng)，必須連續(xù)通入大量無菌空氣，全過程大功率攪拌。發(fā)酵液的預(yù)處理，一般加

4、絮凝劑沉淀蛋白，過濾去除菌絲體，發(fā)酵濾液的提取常用溶媒萃取法、離子交換樹脂法、沉淀法、吸附法等提純濃縮，然后結(jié)晶干燥得純品。,第一節(jié) 抗生素的定義、命名及應(yīng)用,抗生素：是微生物在新陳代謝過程中所產(chǎn)生，具有抑制它種微生物生長及活動，甚至殺死它種微生物的一種化學(xué)物質(zhì)。又稱抗菌物質(zhì)。廣義抗生素：抗生素的來源不僅限于微生物，植物和動物也能產(chǎn)生。如：蒜素、黃連素、魚素等,一、抗生素的定義,常用抗生素命名依據(jù) 由動植物或菌類產(chǎn)生的抗生素，其命

5、名是根據(jù)動物學(xué)、植物學(xué)和菌屬學(xué)的名稱而定。如：青霉素、鏈霉素、蒜素、黃連素、魚素等。,二、抗生素的命名,常用抗生素命名依據(jù) 由抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)明確的族命名。如：四環(huán)素、氯霉素、重氮絲氨酸等。,常用抗生素命名依據(jù) 對一些有重要意義或按抗生素產(chǎn)生菌的出土地方命名及習(xí)慣上采用的俗名仍可使用。如：創(chuàng)新霉素、廬山霉素、平陽霉素、金霉素、土霉素等。,抗生素在醫(yī)療方面的應(yīng)用：治療細(xì)菌、真菌感染的 疾病?？股卦谵r(nóng)牧業(yè)上的應(yīng)用：主要防止

6、農(nóng)作物、禽 畜、蠶蜂的病害，有利于動植物的生長?？股卦谑称繁２丶捌渌矫娴膽?yīng)用：在食品工業(yè) 上，作防腐劑使用。,三、抗生素的應(yīng)用,在食品保藏方面的應(yīng)用－金霉素、土霉素、乳酸菌素使用百萬分之十金霉素溶液保藏活魚，保藏期延長一倍以上。保藏肉類以金霉素和土霉素最有效。于屠宰前不久注射金霉素于體內(nèi)或屠宰后立即注射金霉素（5 %）于動脈中，這類肉在25～29 ℃可保存76 h。鮮乳中加入1 %的四環(huán)素，37℃存放一天不酸

7、敗。鮮菜用2.5 %的土霉素溶液浸泡15 s可保鮮。與抗霉菌抗生素（制霉菌素、匹馬霉素）合并使用，可抑制霉菌的生長。與其它化學(xué)藥物配合使用，產(chǎn)生協(xié)調(diào)作用，抑菌效果更佳。與低溫冷藏結(jié)合。,在食品發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用－新動向谷氨酸發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用青霉素可提高產(chǎn)酸率。抑制產(chǎn)生菌的細(xì)胞壁合成及谷氨酸透出增加有關(guān)。在紡織、塑料、油漆、電氣、精密儀器、化妝品、文物、藝術(shù)制品、圖書等保藏方面應(yīng)用制霉菌素、放線菌酮溶液噴灑后，可防止發(fā)霉。含放線

8、菌酮的涂料，涂抹木箱、紙箱可防止老鼠啃咬。,第二節(jié) 抗生素的分類,抗生素的種類繁多，分類如下一、根據(jù)產(chǎn)生抗生素的來源可分1、細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素：活力不高，毒力較大，臨床應(yīng)用不多。2、真菌產(chǎn)生的抗生素：主要的優(yōu)勢群是不完全綱曲菌屬、青霉屬和頭孢菌屬。在真菌產(chǎn)生的大量抗生素中，因其對生物本身的毒性太大，絕大多數(shù)沒有食用價值。,抗生素的種類繁多，分類如下一、根據(jù)產(chǎn)生抗生素的來源可分3、放線菌產(chǎn)生的抗生素：產(chǎn)生抗生素的主要類群。目前抗

9、生素一半以上由它們產(chǎn)生?？咕?qiáng)，應(yīng)用廣。4、高等植物產(chǎn)生的抗生素：大多數(shù)是被子植物，如蒜、番茄等；裸子植物如銀杏、紅杉等。還有低等植物及中草藥等也能產(chǎn)生抑菌物。,抗生素的種類繁多，分類如下一、根據(jù)產(chǎn)生抗生素的來源可分5、動物產(chǎn)生的抗生素：動物的多種組織能產(chǎn)生抗生素，如從紅血球中提取的紅血球索，從魚精中提取的魚素。,抗生素的種類繁多，分類如下二、根據(jù)抗生素作用對象來分1、抗革蘭氏陽性菌的抗生素：青霉素、桿菌肽、萬古霉素、林可霉

10、素（潔霉素）等。2、抗革蘭氏陽性菌的抗生素：鏈霉素、多粘菌素、春雷霉素等。3、廣譜抗生素：既抗革蘭氏陽性菌又抗革蘭氏陰性菌的抗生素。四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素、紅霉素、頭孢菌素等。,抗生素的種類繁多，分類如下二、根據(jù)抗生素作用對象來分4、抗真菌的抗生素：制霉菌素、灰黃霉素、曲古霉素等。5、抗腫瘤的抗生素：自力霉素（絲裂霉素）、更生霉素（放線菌素Ｄ）、平陽霉素（博萊霉素）、阿霉素等。6、抗病毒及抗原蟲殺昆蟲的抗生素：魚素、抗病毒

11、霉素、曲古霉素（殺滴蟲霉素）、殺狂犬病毒霉素等。7、抗結(jié)核分枝桿菌的抗生素：鏈霉素、利福霉素、環(huán)絲氨酸。,抗生素的種類繁多，分類如下三、根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類1、β－內(nèi)酰胺類抗生素：結(jié)構(gòu)中含有一個四元內(nèi)酰胺環(huán)。如：青霉素、頭孢菌素及其衍生物。2、四環(huán)類抗生素：結(jié)構(gòu)中含有一個四并苯的母核。四環(huán)素、金霉素、土霉素及其衍生物等。3、氨基糖苷類抗生素：結(jié)構(gòu)中含有氨基糖苷和氨基環(huán)醇，如鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素等。4、大環(huán)內(nèi)酯類抗生

12、素：結(jié)構(gòu)中含有一個大環(huán)內(nèi)酯作配糖體，如紅霉素、白霉素、螺旋霉素等。,抗生素的種類繁多，分類如下三、根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類5、多烯大環(huán)類抗生素：結(jié)構(gòu)中含有大環(huán)內(nèi)酯，其內(nèi)含有共軛雙鍵。如：制霉菌素、曲古霉素等。6、多肽類抗生素：結(jié)構(gòu)中由多種氨基酸，經(jīng)肽鍵縮合成線狀、環(huán)狀及帶側(cè)鏈的環(huán)狀多肽化合物。如多粘菌素、桿菌肽、放線菌素等。7、苯烴基胺類抗生素：氯霉素、乙?；让顾氐?。8、蒽酮類抗生素： 正定霉素、光輝霉素、阿霉素等。9、其

13、它抗生素：磷霉素、環(huán)絲氨酸霉素、硫霉素等。,抗生素的種類繁多，分類如下四、根據(jù)抗生素的作用機(jī)制分類1、抑制細(xì)胞壁合成的抗生素：有青霉素頭孢菌素、桿菌肽等。2、影響細(xì)胞膜功能的抗生素：多粘菌素、制霉菌素等。3、抑制和干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的抗生素：四環(huán)類抗生素、氨基糖苷類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素等。4、抑制細(xì)胞核合成的抗生素：利福霉素、色霉素抑制RNA合成；絲裂霉素、博萊霉素、光輝霉素影響DNA功能 等。5、抑制細(xì)菌生物能作用的抗

14、生素：抗霉素、短桿菌肽等。,第三節(jié) 抗生素劑量表示法,抗生素劑量表示法－效價單位抗生素是一種生理活性物質(zhì)，商品中有效成分不可能達(dá)到百分之百，因此，其活性常用效價單位來表示。效價單位：每毫升或每毫克中所含某種抗生素的有效成分的多少。,抗生素效價單位表示方法稀釋單位：將抗生素配成溶液，逐步稀釋，以抑制某一標(biāo)準(zhǔn)菌株生長發(fā)育的最高稀釋度（最小劑量）作為效價單位。常用U/mL或U/mg來表示。如：青霉素曾以在50 mL肉湯培養(yǎng)基中完全抑制金

15、黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株發(fā)育所需要的最小劑量作為一個青霉素的效價單位。鏈霉素曾以在1 mL肉湯培養(yǎng)基中完全抑制大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株發(fā)育所需最小劑量作為一個效價單位。,抗生素效價單位表示方法重量單位：以抗生素的有效成分（生理活性部分）的重量作為單位，即重量單位。如一個鏈霉素堿單位的重量為1微克；一個青霉素G鈉鹽單位的重量為0.6微克等。各種抗生素的效價基準(zhǔn)是人們?yōu)榱松a(chǎn)研究的方便而規(guī)定的，鏈霉素、紅霉素、卡那霉素、萬古霉素、紫霉素等的游離堿，氯

16、霉素、四環(huán)素、金霉素鹽酸鹽，新生霉素酸、利福霉素Sv等，其效價基準(zhǔn)都是以1毫克為1000單位計算。,,某些抗生素的效價基準(zhǔn)是有特殊規(guī)定的，如青霉素G鈉鹽1毫克定位1667單位，桿菌肽1毫克定為55單位，制霉菌素1毫克定位3700單位。一種抗生素有一個效價基準(zhǔn)，同一種抗生素的各種鹽類效價可根據(jù)其分子量與標(biāo)準(zhǔn)鹽類進(jìn)行換算而得。如1毫克青霉素G鈉鹽的理論效價為1667單位／毫克，青霉素G鉀鹽的理論效價U/mg＝青霉素G鈉鹽的理論效價

17、5;青霉素G鈉鹽的分子量÷青霉素G鉀鹽的分子量，得到青霉素G鉀鹽的理論效價為1593 u／mg。同樣，鏈霉素堿理論效價為1000 U/mg，換算得到鏈霉素鹽的理論效價為798 U/mg。,第四節(jié) 青霉素生產(chǎn)工藝　　 最初青霉素的生產(chǎn)菌是音符型青霉菌，生產(chǎn)能力只有幾十個單位，不能滿足工業(yè)需要。隨后找到了適合于深層培養(yǎng)的橄欖型青霉菌，即產(chǎn)黃青霉（P. chrosogenum），生產(chǎn)能力為100U/ml。經(jīng)過X、紫外線誘變，生

18、產(chǎn)能力達(dá)到1000－1500U/ml。隨后經(jīng)過誘變，得到不產(chǎn)生色素的變種，目前生產(chǎn)能力可達(dá)66000－70000U/ml。青霉素是抗生素工業(yè)的首要產(chǎn)品。中國為青霉素（penicillin）生產(chǎn)大國，國內(nèi)生產(chǎn)的青霉素，已占世界產(chǎn)量的近70%，國內(nèi)較大規(guī)模的生產(chǎn)企業(yè)有華藥、哈醫(yī)藥、石藥、魯抗，單個發(fā)酵罐規(guī)模均在100m3以上，發(fā)酵單位在70000U/ml左右，而世界青霉素工業(yè)發(fā)酵水平達(dá)100000U/ml以上。,青霉素的作用機(jī)理　　 作用

19、于細(xì)胞壁合成中的肽多糖合成的第三階段，線性肽多糖在轉(zhuǎn)肽酶的催化下進(jìn)行交聯(lián)，肽多糖鏈之間每兩條肽鏈結(jié)合時均釋放出一個D－丙氨酸，青霉素中與肽多糖的D－丙胺酰－D－丙氨酸二肽相似，競爭性的與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，使轉(zhuǎn)肽酶不能催化多肽鏈之間的交聯(lián)。,青霉素應(yīng)用　　 臨床應(yīng)用：40多年，主要控制敏感金黃色葡糖球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、淋球菌、腦膜炎雙球菌、螺旋體等引起感染，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌）和某些革蘭氏陰性細(xì)菌及螺旋體有抗菌作用。

20、優(yōu)點(diǎn)：毒性小，但由于難以分離除去青霉噻唑酸蛋白（微量可能引起過敏反應(yīng)），需要皮試?！　?各種半合成抗生素的原料：青霉素的缺點(diǎn)是對酸不穩(wěn)定，不能口服，排泄快，對陰性菌無效。氨芐青霉素耐酸廣譜；對抗綠膿桿菌的磺芐青霉素，耐酸、耐酶、口服的乙氧萘青霉素等。提供頭孢菌素母核。,一、青霉素的類型及生產(chǎn)菌種1、青霉素的類型 青霉素是一族抗生素的總稱，由不同的菌種或不同的培養(yǎng)條件所得到的一類化學(xué)物質(zhì)。已知天然青霉素（發(fā)酵）有8種，含6

21、－氨基青霉烷酸（6－APA）。以芐青霉素（青霉素G）療效最好，應(yīng)用最廣。醫(yī)療上應(yīng)用的青霉素有青霉素G鈉鹽、鉀鹽、普魯卡因鹽。,2、青霉素生產(chǎn)菌種原始菌種：點(diǎn)青霉菌（Penicillum notatum），生產(chǎn)能 力低，表面培養(yǎng)只有幾個單位。深層培養(yǎng)菌種：產(chǎn)黃青霉（Pen.chrysogenum），經(jīng)一系列誘變、雜交育種等，新菌種不斷出現(xiàn)。,目前生產(chǎn)菌種：根據(jù)深層培養(yǎng)的菌絲形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種。絲狀菌：分黃孢子和綠孢子絲狀菌

22、。我國生產(chǎn)上大多采用產(chǎn)黃青霉素變種，綠色絲狀菌。球狀菌：分為綠色孢子和白色孢子球狀菌。目前生產(chǎn)上多用白色孢子球狀菌。,發(fā)酵條件下的生長過程　　第1期：分生孢子萌發(fā)，形成芽管，原生質(zhì)未分化，具有小泡?！　〉?期：菌絲繁殖，原生質(zhì)體具有嗜堿性，類脂肪小顆粒?！　〉?期：形成脂肪包涵體，機(jī)理貯藏物，沒有空泡，嗜堿性很強(qiáng)?！　〉?期：脂肪包涵體形成小滴并減少，中小空泡，原生質(zhì)體嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素?！　〉?期：形成大空泡，有中

23、性染色大顆粒，菌絲呈桶狀，脂肪包涵體消失，青霉素產(chǎn)量最高?！　〉?期：出現(xiàn)個別自溶細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)無顆粒，仍然桶狀。釋放游離氨，pH上升?！　〉?期：菌絲完全自溶，僅有空細(xì)胞壁?！　＄R檢：規(guī)定時間取樣，顯微鏡觀察7個時期的形態(tài)變化，控制發(fā)酵?！　?－4期為菌絲生長期，3期的菌體適宜為種子?！　?－5期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，通過工程措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。　　在第6期到來之前結(jié)束發(fā)酵。,二、青霉素的發(fā)酵工藝,(一)發(fā)酵工藝流程

24、,,,(一)發(fā)酵工藝操作要點(diǎn),1、種子絲狀菌種子的制備 生產(chǎn)孢子的制備： 由沙土管內(nèi)孢子在拉氏培養(yǎng)基的母頸斜面上，25℃，培養(yǎng)6～7 d，制成綠色孢子懸浮液，再接入裝有大米 的茄子瓶培養(yǎng)6～7 d，大米孢子干燥保存。每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗，測定效價及雜菌情況。 種子罐種子：種子培養(yǎng)要求產(chǎn)生大量健壯的菌絲體，因此，培養(yǎng)基應(yīng)加入比較豐富的易利用的碳源和有機(jī)氮源。,青霉素采用三級發(fā)酵 一級種子發(fā)酵：

25、發(fā)芽罐.小罐，接入小米孢子后，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基成分：葡萄糖，蔗糖，乳糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等。通無菌空氣，空氣流量1：3（體積比）；充分?jǐn)嚢?00－350r/min；40～50小時；pH自然，溫度27±1℃?！《壈l(fā)酵罐：繁殖罐.大量繁殖。玉米漿、葡萄糖等。1：1－1.5；250－280r/min；pH自然，25±1℃；0－14h。,三級發(fā)酵罐：生產(chǎn)罐?；ㄉ灧郏ǜ邷兀?，麩質(zhì)粉、玉米漿、葡萄糖

26、，尿素，硫酸銨，硫酸鈉、硫代硫酸鈉，磷酸二氫鈉，苯乙酰胺及消泡劑，CaCO3等。接種量為12～15%。青霉素的發(fā)酵對溶氧要求極高，通氣量偏大，通氣比控制0.7～1.8；150－200r/min；要求高功率攪拌，100m3的發(fā)酵罐攪拌功率在200～300 Kw，罐壓控制0.04～0.05 MPa，于25～26 ℃下培養(yǎng)，發(fā)酵周期在200h左右。前60h，pH5.7～6.3，后6.3～6.6；前60h為26℃，以后24℃。,球狀菌生產(chǎn)種子的

27、制備 原始親米孢子： 由凍干管內(nèi)孢子經(jīng)混有0.5 %～1.0 %玉米漿的大米三角瓶內(nèi)，25℃靜置培養(yǎng)3～4 d，大米表面長出明顯小菌落時，要振搖均勻使菌絲在大米表面生長均勻，10 d左右長出綠色孢子即為原始親米孢子。5 ℃保存10 d內(nèi)。 生產(chǎn)大米孢子（生產(chǎn)米）：將親米孢子接入裝有大米的羅氏瓶劇烈正要均勻后，按上述方法培養(yǎng)。生產(chǎn)米的孢子量要求每粒米300 萬只以上。 5 ℃保存。 種子罐種子：新鮮的生產(chǎn)

28、米接入含花生餅粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、飴糖為主的種子罐內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)50～60 h，當(dāng)pH6.0～6.5降至5.5～5.0時，菌絲呈菊花團(tuán)狀平均直徑100～130 μm，6～8 萬只/mL。根據(jù)發(fā)酵罐的菌球數(shù)控制在8000～11000 只/mL，計算移種體積。,球狀菌種子的優(yōu)點(diǎn)使用的是新鮮孢子，生產(chǎn)水平優(yōu)于真空干燥的孢子，能使青霉素發(fā)酵單位的罐批差異減少,2、培養(yǎng)基碳源：葡萄糖母液和工業(yè)葡萄糖為主。氮源：花生餅粉、尿素、玉米胚芽

29、粉、麩質(zhì)粉。前提物：苯乙酸（鹽類）、苯乙酰胺，一部結(jié)合到青霉素 分子中，一部作為養(yǎng)料和能源。使用量在 0.1% 以內(nèi)，對 青霉素生產(chǎn)菌有毒。無機(jī)鹽：硫、磷，鐵（6 μg/mL），鉀、鈣、鎂（比例為 30 %， 20 %， 41 %）總量在300 mg/L青霉素產(chǎn)量最高 。,3、培養(yǎng)條件控制 產(chǎn)青霉素菌生產(chǎn)過程分3個不同的代謝時期Ⅰ菌絲生長繁殖期：球狀菌孢子發(fā)芽后，菌絲生長逐步發(fā)育 成球狀，菌絲體

30、濃度迅速增加；絲狀菌孢子發(fā)芽長出菌 絲，分枝旺盛，菌絲濃度增加很快。青霉素分泌量很少。Ⅱ青霉素分泌期：菌絲生長趨勢減弱，間隙加入葡萄糖、花 生餅粉、尿素、前提物，控制球狀菌pH6.6～6.9，絲狀菌 pH6.2～6.4，青霉素分泌旺盛。菌體要求：球狀菌的球體 不可太松或的太緊；絲狀菌的菌絲體內(nèi)的空胞為中、小型 至中型，不要出現(xiàn)大型空胞。Ⅲ 菌絲自溶期：菌體衰老，青霉素分泌停滯或下跌

31、，pH上 升。鏡檢：球狀菌的球體破裂比例迅速增加；絲狀菌的大 型空胞。,青霉素發(fā)酵要求延長分泌期縮短菌絲生長繁殖期控制菌絲期自溶盡晚出現(xiàn),青霉素發(fā)酵工藝控制方法加糖控制：依據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵過程pH定。補(bǔ)料及添加前提物：絲狀菌接種發(fā)酵8～12 h，發(fā)酵液 濃度40 %，加入前提；球狀菌發(fā)酵10 h開始尿素、 水和苯乙酸混合料，每3 h加一次，由單位生長速率 決定加入量。pH控制：

32、青霉素發(fā)酵過程主要是通過葡萄糖控制pH值。 絲狀菌發(fā)酵pH6.2～6.4，球狀菌pH6.7～7.0。,青霉素發(fā)酵工藝控制方法溫度控制：青霉素菌生長最適溫度高于青霉素分泌的最適溫 度。絲狀菌發(fā)酵溫度：26－24－23－22℃，生長濃度48 %～ 54 %；球狀菌發(fā)酵溫度： 26－25－24℃，發(fā)酵濃度50 %。通氣與攪拌：青霉素的深層發(fā)酵需要通入空氣攪拌增加溶解 氧。溶氧＜30％飽和度，產(chǎn)率急劇下降，低

33、于10％，則造成不可逆的損害。所以不能低于30％飽和溶氧濃度。通氣比一般為1：0.8VVM。溶氧過高，菌絲生長不良或加糖率過低，呼吸強(qiáng)度下降，影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。適宜的攪拌速度，保證氣液混合，提高溶氧，根據(jù)各階段的生長和耗氧量不同，對攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整。,（5）菌絲生長速度與形態(tài)、濃度　　 對于每個有固定通氣和攪拌條件的發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行的特定好氧過程，都有一個使氧傳遞速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上達(dá)到平衡的臨界菌絲濃，超過此

34、濃度，OUR＞OTR，溶氧水平下降，發(fā)酵產(chǎn)率下降。在發(fā)酵穩(wěn)定期，濕菌濃可達(dá)15~20%，絲狀菌干重約3%，球狀菌干重在5%左右。另外，因補(bǔ)入物料較多，在發(fā)酵中后期一般每天帶放一次，每次放掉總發(fā)酵液的10%左右?！　?有絲狀生長和球狀生長兩種。前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基質(zhì)及氧接觸，比生產(chǎn)率高，發(fā)酵粘度低，氣/液兩相中氧的傳遞率提高，允許更多菌絲生長。球狀菌絲形態(tài)的控制，與碳、氮源的流加狀況，攪拌的剪切強(qiáng)度及稀釋度相關(guān)。,青

35、霉素發(fā)酵工藝控制方法泡沫與消泡：青霉素發(fā)酵過程不斷產(chǎn)生泡沫。天然消泡劑為豆 油、玉米油，化學(xué)合成消泡劑－泡敵（聚醚樹脂類）部分代替 天然油脂。,染菌及早期異常處理發(fā)酵罐前期或種子帶菌：若發(fā)酵罐前期染菌或種子帶菌，一般 可采用重新消毒并補(bǔ)入適量的糖、氮成分。中后期發(fā)生染菌：若是產(chǎn)氣細(xì)菌則應(yīng)及時放罐過濾、提煉，事 后徹底消毒處理。若遇發(fā)酵前期菌絲生長不良：發(fā)酵異常時可采取倒出部分發(fā)酵 液，補(bǔ)入部分

36、新鮮料液和良好的種子。,三、青霉素的提煉工藝,(一)提煉工藝流程,1、工業(yè)鉀鹽生產(chǎn)工藝流程,2、注射用鉀鹽生產(chǎn)工藝流程,,3、青霉素鈉鹽結(jié)晶,,青霉素不穩(wěn)定，整個提煉過程應(yīng)在低溫、快速的條件下進(jìn)行，并嚴(yán)格控制pH值，注意對清洗消毒減少污染，盡量避免或減少青霉素效價的破壞損失。1、發(fā)酵液的預(yù)處理和過濾發(fā)酵液放罐后，首先要冷卻。因為青霉素在低溫是比較穩(wěn)定，同時細(xì)菌繁殖也比較慢，可避免青霉素迅速破壞，發(fā)酵液除冷卻外還需進(jìn)行預(yù)處理.發(fā)酵液結(jié)

37、束后，目標(biāo)產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，而且濃度較低，如抗生素只有10－30Kg/m3，含有大量雜質(zhì)，它們影響后續(xù)工藝的有效提取，因此必須對其進(jìn)行的預(yù)處理，目的在于濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過程。是進(jìn)行分離純化的一個工序。如果發(fā)酵液不經(jīng)處理而直接過濾，雖然能除去大部分不溶性固體雜質(zhì)，但濾液中還剩余一部分微小顆粒和易容性蛋白質(zhì)等物質(zhì)，濾液外觀上是混濁的，假若不除去這部分雜質(zhì)，會給后步提煉帶來很大困難，為

38、了要除去這部分雜質(zhì)，所以要對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理。,(二)提煉工藝要點(diǎn),4.2 過濾發(fā)酵液在萃取之前需預(yù)處理，發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白，然后經(jīng)真空轉(zhuǎn)鼓過濾或板框過濾，除掉菌絲體及部分蛋白。青霉素易降解，發(fā)酵液及濾液應(yīng)冷至10 ℃以下，過濾收率一般90%左右。（1）菌絲體粗長10μm，采用鼓式真空過濾機(jī)過濾，濾渣形成緊密餅狀，容易從濾布上刮下。濾液pH6.27-7.2，蛋白質(zhì)含量0.05-0.2%。需要進(jìn)一步除去蛋白質(zhì)。（2）改善過濾

39、和除去蛋白質(zhì)的措施：硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB，0.7%硅藻土為助濾劑。再通過板框式過濾機(jī)。濾液澄清透明，進(jìn)行萃取。,4.3 萃取青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而青霉素鹽易溶于水。利用這一性質(zhì)，在酸性條件下青霉素轉(zhuǎn)入有機(jī)溶媒中，調(diào)節(jié)pH，再轉(zhuǎn)入中性水相，反復(fù)幾次萃取，即可提純濃縮。選擇對青霉素分配系數(shù)高的有機(jī)溶劑。工業(yè)上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取2～3次。從發(fā)酵液萃取到乙酸

40、丁酯時，pH選擇1.～2.0，從乙酸丁酯反萃到水相時，pH選擇6.8～7.4。發(fā)酵濾液與乙酸丁酯的體積比為1.5～2.1，即一次濃縮倍數(shù)為1.5～2.1。為了避免pH波動，采用硫酸鹽、碳酸鹽緩沖液進(jìn)行反萃。發(fā)酵液與溶劑比例為3～4。幾次萃取后，濃縮10倍，濃度幾乎達(dá)到結(jié)晶要求。萃取總收率在85％左右。,4.4 脫色萃取液中添加活性炭，除去色素、熱源，過濾，除去活性炭。,3、結(jié)晶 萃取液一般通過結(jié)晶提純。青霉素鉀鹽在醋酸

41、丁酯中溶解度很小，在二次丁酯萃取液中加入醋酸鉀-乙醇溶液，青霉素鉀鹽就結(jié)晶析出。然后采用重結(jié)晶方法，進(jìn)一步提高純度，將鉀鹽溶于KOH溶液，調(diào)pH至中性，加無水丁醇，在真空條件下，共沸蒸餾結(jié)晶得純品。 直接結(jié)晶：在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸鈉－乙醇溶液反應(yīng)，得到結(jié)晶鈉鹽。加醋酸鉀－乙醇溶液，得到青霉素鉀鹽。 共沸蒸餾結(jié)晶：萃取液，再用0.5 M NaOH萃取，pH6.4～4.8下得到鈉鹽水濃縮液。加2.5倍

42、體積丁醇，16～26℃，0.67～1.3KPa下蒸餾。水和丁醇形成共沸物而蒸出。鈉鹽結(jié)晶析出。結(jié)晶經(jīng)過洗滌、干燥后，得到青霉素產(chǎn)品。結(jié)晶是提純物質(zhì)的有效方法。如在第二次丁酯萃取液中，青霉素的純度只有70 %，但結(jié)晶后純度提高至98 %以上。青霉素的結(jié)晶方法有很多，如堿金屬鹽和普魯卡因鹽等。,pH值 結(jié)合青霉素在各種pH下的穩(wěn)定性和青霉素在醋酸丁脂及水中的分配系數(shù)以及青霉素的pK值（25℃ 時為2.76）一般從濾液萃取到醋酸丁酯時，p

43、H選擇在1.8～2.2范圍內(nèi)，而從丁脂反萃取到水相時，pH選擇在6.8－7.2之間?！?2、影響青霉素提取的主要因素,溫度： 青霉素在低溫下比較穩(wěn)定，因此低溫（一般要求在10。以下）提取較為有利。在提取設(shè)備上要考慮用冷鹽水（夾層或蛇管）進(jìn)行冷卻，降低溫度，特別是酸化崗位，溫度要求更低些。時間： 除了嚴(yán)格控制pH和低溫條件外，青霉素在提取液中停留的時間越短越好，因此要求操作熟練，設(shè)備良好，不發(fā)生障礙。酸化提取是速度應(yīng)快些，數(shù)秒鐘液體充分

44、混合后應(yīng)立即分離，使青霉素游離酸盡快地轉(zhuǎn)移到醋酸丁酯中（因為青霉素游離酸在丁酯中比青霉素鹽類在水中要穩(wěn)定得多）。,萃取方式和濃縮比：根據(jù)萃取方式及理論收得率得知，多級逆流萃取較理想，目前生產(chǎn)上一般采用二級逆流萃取方式，濃縮比的選擇也很重要，因為丁酯的用量與收率和質(zhì)量都有關(guān)系。 如果丁酯用量過多，雖然萃取較完全，收率高，但達(dá)不到結(jié)晶濃度要求，反而增加溶媒的耗用量；如果丁酯的用量太少，則萃取不完全，影響收率。 據(jù)國

45、外報道，丁酯用量為濾液的25%～30 %，色素相對含量低，青霉素的純度最高，因此稱之為丁酯用量的最佳條件。 目前生產(chǎn)上從濾液萃取到丁酯是濃縮比為1.5～2.5倍，從丁酯反萃取到水相時，因分配系數(shù)較大，故濃縮倍數(shù)可較高些，一般為3－5倍。經(jīng)過幾次反復(fù)萃取后共約濃縮10倍左右，濃度已符合晶體要求。,第五節(jié) 紅霉素生產(chǎn)工藝p287,一、紅霉素的類型及生產(chǎn)菌種1、紅霉素的類型 紅霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其分子內(nèi)含有大的內(nèi)

46、酯環(huán)。因結(jié)構(gòu)中的化學(xué)基團(tuán)不同，可分為紅霉素A、紅霉素B、紅霉素C、紅霉素D四種。醫(yī)療上使用的均是紅霉素A。主要抗革蘭氏陽性菌及某些革蘭氏陰性菌，可用于對青霉素耐藥及過敏的病人。,2、紅霉素生產(chǎn)菌種產(chǎn)生菌：紅色鏈霉菌（Streptomyces erythreus）。 在特定培養(yǎng)條件下產(chǎn)生多組分的紅霉素，紅霉素A 為有效成分，紅霉素B、C為雜質(zhì)?，F(xiàn)用產(chǎn)生菌不合 成紅霉素B，故紅霉素C為國產(chǎn)紅霉素的主要雜質(zhì)。P32

47、-102菌株：60年代使用，生產(chǎn)水平不高，易被噬 菌體污染?，F(xiàn)代菌種：具有抗噬菌體的特性，合成紅霉素A的含 量高，紅霉素C的含量低。,二、紅霉素的發(fā)酵工藝,（二）紅霉素的發(fā)酵工藝要點(diǎn),1、種子母瓶孢子：沙土管保存的孢子接種于母瓶斜面上，37℃培 養(yǎng)9 d。使用周期1個月。子瓶孢子：接種母瓶孢子后， 37℃培養(yǎng)7 d。孢子呈深米 黃色、色澤鮮艷、均勻、無黑點(diǎn)，孢瓶背面有紅色色 素，孢子數(shù)不低于1

48、億個/瓶。使用周期2個月。種子罐：接入子瓶孢子，35℃培養(yǎng)65 h。繁殖罐：接入種子罐菌種，33℃培養(yǎng)40 h。,2、培養(yǎng)基碳源：葡萄糖母液為主，淀粉其次。氮源：黃豆餅粉為主，其次是玉米漿和硫酸銨。中間補(bǔ)料 花生餅粉、蛋白胨、酵母粉和氨水。前提物：丙酸或丙醇提供甲基供體有利于紅霉素C向紅霉 素A轉(zhuǎn)化。,3、培養(yǎng)條件控制 通氣與攪拌：發(fā)酵罐的通氣量一般為1∶ 0.8 ～ 1.2 （v/v/min）。增加

49、空氣流量和加快攪拌轉(zhuǎn)速會提高發(fā) 酵單位。同時要加強(qiáng)補(bǔ)料的工藝控制，防止菌絲早衰 自溶。過低的空氣通入量會導(dǎo)致發(fā)酵液轉(zhuǎn)稀。,溫度控制：紅色鏈霉菌對溫度敏感，全程31℃培養(yǎng)（若遇 發(fā)酵劇烈有轉(zhuǎn)稀趨勢時適當(dāng)降低發(fā)酵溫度），48 h粘度大 高峰期，菌體衰老較慢，發(fā)酵液轉(zhuǎn)稀時間推遲。pH控制：整個發(fā)酵過程維持pH6.6～7.2，菌絲生長良 好，不自溶，發(fā)酵單位穩(wěn)定。pH過低紅霉素合成完全停 止，過高（pH

50、大于7.2）菌絲自溶，導(dǎo)致紅霉素C的比例 增加，紅霉素A含量相應(yīng)降低。,中間補(bǔ)料補(bǔ)糖：發(fā)酵過程，發(fā)酵液中還原糖控制在1.2%～1.5 %范圍 內(nèi)，每隔6 h加入葡萄糖，直至放罐前12～18 h停止加糖。補(bǔ)有機(jī)氮：每天補(bǔ)加3～4次，補(bǔ)加量由發(fā)酵液粘度決定，若 粘度低，可增加補(bǔ)料量；若粘度高，可減少補(bǔ)料量，過高還 可補(bǔ)加適量水，放罐24 h前停止補(bǔ)料。補(bǔ)前提物：一般在發(fā)酵24～39 h，當(dāng)發(fā)酵液變濃，pH高于6

51、.5 時開始補(bǔ)入，每隔24 h加一次，全程共加4～5次，總量為0.7 %～0.8 %，遇發(fā)酵單位增長趨勢好時可適當(dāng)多加。,三、紅霉素的提煉工藝,（一）提煉工藝流程,1、溶媒法提煉紅霉素工藝流程,2、溶媒法提煉紅霉素工藝流程,3、薄膜濃縮法提煉紅霉素工藝流程,,紅霉素是一種堿性抗生素，利用它在不同酸、堿度能溶解在不同溶劑中的特性，采用在醋酸丁酯及在水溶液中反復(fù)萃取而提純和濃縮，最后在27～30萬U/mL的丁酯溶液中冷凍結(jié)晶

52、，即制成紅霉素堿成品。1、發(fā)酵液的預(yù)處理和過濾發(fā)酵液中含有低濃度（0.8 %）的紅霉素，絕大部分是菌絲體和未發(fā)酵的培養(yǎng)基及代謝產(chǎn)物。蛋白質(zhì)的存在在溶媒萃取時將產(chǎn)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，給提煉帶來困難，需對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理和過濾。 用硫酸鋅（氯化鋁）沉淀蛋白質(zhì)，使菌絲結(jié)團(tuán)加快濾速。,(二)提煉工藝要點(diǎn),2、防止和去除乳化 減少乳化，關(guān)鍵在于發(fā)酵液處理好，無混濁現(xiàn)象。同時選擇合適乳化劑。早期去乳化劑：溴代十五烷吡啶（PPB）

53、，缺點(diǎn)：對成品色級有一定影響。改進(jìn)去乳化劑：十二烷基磺酸鈉（DS），色澤有所改進(jìn)，但帶來污染。酶制劑去乳化劑：蛋白酶和酯酶。,在萃取過程中，堿化和酸化的紅霉素的收率和產(chǎn)品質(zhì)量都有直接影響。堿化時：pH控制在10±0.5范圍較適宜。過高，將引起紅霉素的堿性破壞，使乳濁更嚴(yán)重；過低，對萃取不利，影響收率。酸化時： pH控制在4.9±0.3范圍，過高，對紅霉素穩(wěn)定有利，但對萃取不利，影響收率；過低，對萃取有利，但紅