核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用

1、核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用,衛(wèi)生部臨檢中心深圳市血液中心血液病毒核酸檢測聯(lián)合實驗室,葉賢林,2024/3/17,2,核酸擴(kuò)增檢測實驗室的建立,人員場地檢測方法選擇實施方案依據(jù)：衛(wèi)生部頒發(fā)的《臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號）,2024/3/17,3,核酸實驗室人員要求,資質(zhì):經(jīng)過臨檢中心PCR培訓(xùn)班培訓(xùn)并取得上崗證；通過血站核酸實驗室崗前培訓(xùn)考試合格。 培訓(xùn):①無”核酸”的概念形成, ②防污染的概

2、念③良好工作習(xí)慣的培養(yǎng). ④報告的正確發(fā)放.后備人員的培養(yǎng).,2024/3/17,4,試劑準(zhǔn)備區(qū),,標(biāo)本制備區(qū),,擴(kuò)增區(qū)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū),樣本離心交接區(qū),,,報告發(fā)放區(qū),核酸實驗場地,2024/3/17,5,方法選擇: TMA與PCR,2024/3/17,6,TMA的優(yōu)點 缺點,自動化程度高,靈敏度高,擴(kuò)增效率高：10n,不能絕對定量,2024/3/17,7,PCR的優(yōu)點

3、 缺點,易于自動化,靈敏度高,擴(kuò)增效率高,匯集拆分過程繁瑣,拆分可減低非反應(yīng)性比率,2024/3/17,8,核酸試劑質(zhì)控,試劑的確認(rèn) 試劑運輸過程的控制(溫度\條件\時限) 靈敏度的要求 內(nèi)標(biāo)的要求試劑涵蓋的基因型,2024/3/17,9,檢測流程(1):常規(guī)篩查合格匯集標(biāo)本檢測流程,2024/3/17,10,檢測流程(2):常規(guī)篩查合格單人份標(biāo)本檢測流程,2024/3/17,11,檢測流程(3):平行檢測

4、流程,樣本清點交接,核酸單份檢測,常規(guī)檢測,合格標(biāo)本,不合格標(biāo)本,陰性標(biāo)本,反應(yīng)性標(biāo)本,,,,,,,,,合格標(biāo)本發(fā)布結(jié)果,,,,單項目反應(yīng)性,無反應(yīng)性,,,,,陽性或可疑結(jié)果淘汰,,,,,,,,,,陽性或可疑結(jié)果淘汰,,,2024/3/17,12,標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)的編寫,核酸實驗室設(shè)置與管理規(guī)范核酸實驗室標(biāo)本檢測流程核酸實驗室崗位職責(zé)核酸實驗室關(guān)鍵試劑管理規(guī)范核酸實驗室儀器設(shè)備管理規(guī)范核酸實驗室檢測標(biāo)本管理規(guī)范核酸實驗

5、室室間質(zhì)量評價規(guī)范核酸實驗室記錄管理制度核酸實驗室生物防護(hù)規(guī)范核酸反應(yīng)性獻(xiàn)血者追蹤規(guī)程核酸實驗室檢測應(yīng)急措施,2024/3/17,13,標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)的編寫,核酸標(biāo)本離心交接操作規(guī)程核酸標(biāo)本提取及匯集操作規(guī)程(科華) 核酸標(biāo)本擴(kuò)增檢測操作規(guī)程（科華）核酸標(biāo)本全自動檢測分析系統(tǒng)操作規(guī)程（CHIRON）核酸標(biāo)本檢測報告發(fā)布操作規(guī)程（唐山軟件）核酸標(biāo)本檢測復(fù)檢操作規(guī)程生物安全柜標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程可移動紫外線燈標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)

6、程低溫高速離心機標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程ABI 7300型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,2024/3/17,14,核酸實驗室防污染措施,主要的污染源擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)本之間產(chǎn)生的氣溶膠操作人員手衣服,2024/3/17,15,核酸實驗室防污染措施,要有獨立的空氣處理系統(tǒng).各區(qū)始終處于完全分隔的狀態(tài)，不能有空氣的直接相通實驗室保持合理的通風(fēng)對各區(qū)內(nèi)的設(shè)備、物料進(jìn)行標(biāo)示，專區(qū)專用；其他物品不得混用（例如：筆、紙張）空氣：試劑準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本

7、制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)試劑陽性對照儲存在標(biāo)本制備區(qū)使用帶濾芯的吸頭,2024/3/17,16,核酸實驗室防污染措施,使用外排式的生物安全柜自配試劑應(yīng)分裝成小規(guī)格，未用完的試劑應(yīng)廢棄使用次氯酸鈉溶液消毒（臺面、地面）使用1mol/L的HCL溶液（吸頭）使用紫外線照射（空氣和臺面）使用無水乙醇溶液（空氣噴霧）,2024/3/17,17,核酸實驗室污染后措施,實驗室污染后，如何處理？通風(fēng)次氯酸鈉溶液（擴(kuò)增區(qū)不宜使用）H

8、CL溶液（吸頭）紫外線（固定、移動）酒精噴灑（空氣）應(yīng)設(shè)計有備用實驗室 : 如開設(shè)獨立的報告發(fā)放區(qū)作為備用,2024/3/17,18,中心理念：監(jiān)測全程的實驗過程包含病毒核酸提取、反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增過程的效率。,血篩核酸檢測的內(nèi)標(biāo)的作用,內(nèi)標(biāo)的作用質(zhì)控整個反應(yīng)。提示假陰性檢測結(jié)果。監(jiān)控反應(yīng)的外部條件內(nèi)標(biāo)濃度要合適保持適度的內(nèi)標(biāo)失控.(<0.2%),2024/3/17,19,核酸試劑靈敏度評估,概率單位回歸分析 (PROB

9、IT）用于描述劑量-反應(yīng)或不同因素間的劑量-反應(yīng)比較，反應(yīng)結(jié)果應(yīng)該是以二分類形式表達(dá)的。概率單位的回歸方程為： PROBIT Pi=A+BXi,2024/3/17,20,用國際標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度評估血液HBV核酸篩查方法，結(jié)果如下。請計算95%的檢出限量及可信范圍CI,2024/3/17,21,Analysis of Parameter Estimates 

10、 Standard 95% Confidence Chi- Parameter DF Estimate Error Limits Square Pr > ChiSq  Intercept 1 -4.6852 1.5659 -7.7542 -1.6161 8.95 0.0028log10(Dose) 1

11、4.8000 1.4699 1.9190 7.6810 10.66 0.0011,應(yīng)用SAS9.0軟件PROBIT分析結(jié)果,2024/3/17,22,Probit Analysis on Dose Probability Dose 95% Fiducial Limits 0.50

12、 9.57017 5.12038 15.55110 0.55 10.63175 6.02869 17.84047 0.60 11.83113 7.02737 20.77334 0.65

13、 13.21316 8.12392 24.64098 0.70 14.84467 9.33581 29.90750 0.75 16.83205 10.69944 37.36963 0.80

14、 19.35973 12.28641 48.54111 0.85 22.78900 14.24179 66.74000 0.90 27.97953 16.90417 101.07479 0.9

15、1 29.40116 17.58727 111.93157 0.92 31.02755 18.34915 125.13015 0.93 32.91988 19.21204 141.54165 0

16、.94 35.17006 20.20878 162.54851 0.95 37.92474 21.39086 190.49822,2024/3/17,23,2024/3/17,24,陽性獻(xiàn)血者的追蹤,溝通原則:專業(yè)授權(quán)、人性化、保密、尊敬。溝通方式：電話、面談溝通技巧：表揚和鼓勵、合理解釋、知情、適當(dāng)?shù)膯柡?2024/3/1

17、7,25,獻(xiàn)血者核酸檢測不合格解釋,由于核酸檢測方法目前尚不能排除假陽性，對實驗過程要求極高，另外乙肝和丙肝病毒進(jìn)入人體后，人體又有清除現(xiàn)象，但血液不能用于臨床，因此核酸檢測不合格血液僅表示該血液不能用于臨床輸血。不作為獻(xiàn)血者健康體檢指標(biāo)。更不宜作為疾病診療指標(biāo)。獻(xiàn)血者獻(xiàn)血權(quán)利仍保留。,2024/3/17,26,關(guān)于核酸檢測的解釋,匯集結(jié)果成反應(yīng)性,拆分結(jié)果為陰性.內(nèi)標(biāo)失敗.ELISA(+),核酸結(jié)果為(-)ELISA(-)

18、,核酸結(jié)果為(+)核酸單檢結(jié)果反應(yīng)性與血液發(fā)放.化學(xué)發(fā)光法與核酸檢測.,2024/3/17,27,1.靈敏度：匯集池大小要滿足靈敏度要求。靈敏度太低，病毒低載量獻(xiàn)血者漏檢。HBV DNA 靈敏度宜50拷貝/ml.2.引物是否有效性,能否檢測亞型和突變株感染。3.假陽性，防污染措施（血篩主要要防止RNA酶的污染）。4.核酸提取效率與自動化.5.需要規(guī)范化場地和高素質(zhì)的操作人員.6.參加國際間室間質(zhì)控,提高檢測水準(zhǔn).,血液核

19、酸篩查注意的問題,2024/3/17,28,深圳血液中心核酸檢測概況,對161228人份酶免疫檢測結(jié)果陰性標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測，共檢出33例不相同HBV DNA陽性獻(xiàn)血者，總比率為1：4885。檢出anti-HCV陰性、 HCV RNA陽性1例，定量結(jié)果為1.2×105IU/ml。3個月后追蹤結(jié)果發(fā)現(xiàn)anti-HCV（+），ALT由正常升高至700U/L。,2024/3/17,29,,深圳血液中心核酸檢測概況,2024/3/17

20、,30,HBV DNA陽性獻(xiàn)血者追蹤情況,對17位HBV DNA陽性獻(xiàn)血者進(jìn)行了追蹤，9位獻(xiàn)血者發(fā)生血清轉(zhuǎn)換現(xiàn)象。4例呈窗口期特征（或部分），2例獻(xiàn)血者發(fā)現(xiàn)病毒感染后自愈現(xiàn)象1例獻(xiàn)血者原為乙肝大三陽患者，經(jīng)治療后HBsAg轉(zhuǎn)陰后，獻(xiàn)血，常規(guī)檢測為合格，核酸檢測HBV DNA（+），經(jīng)追蹤后HBsAg變?yōu)殛栃?2024/3/17,31,2024/3/17,32,2024/3/17,33,2024/3/17,34,2024/3/17,

21、35,2024/3/17,36,HBV DNA檢測陽性獻(xiàn)血者追蹤概況,2024/3/17,37,1號獻(xiàn)血者在追蹤時表明曾經(jīng)是大三陽,治療轉(zhuǎn)陰后獻(xiàn)血,被核酸檢出陽性,7天后 HBsAg 檢測(+).,2024/3/17,38,2024/3/17,39,1.Pooling by STAR processor,2.Virus enrichment by centrfugation,3. Extracted by KHB-1000,4. Amp

22、lified and detected by ABI7300,2024/3/17,40,2024/3/17,41,1.pooling and extraction by STAR LET,2. Amplification and detection by ABI7300,Automation process,2024/3/17,42,,,2024/3/17,43,2024/3/17,44,,,2024/3/17,45,MANY THAN