人肝癌細胞系SMMC-7721中肝癌干細胞樣細胞的初步探討.pdf

1、目的:探索獲取肝癌干細胞樣細胞的方法并觀察其生物學特性及腫瘤干細胞表面標志物表達情況。
　　方法:
　　1、收集采用普通培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)與采用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的人肝癌細胞株SMMC-7721細胞。
　　2、在倒置顯微鏡下觀察兩種培養(yǎng)方法處理后的人肝癌細胞株SMMC-7721腫瘤細胞的形態(tài)學特征。
　　3、流式細胞儀檢測兩種培養(yǎng)方法處理后的人肝癌細胞株SMMC-7721腫瘤細胞中腫瘤干細胞表面標志CD90、CD1

2、33、CD24的各自表達量。
　　4、SYBR GreenⅠ Real-Time PCR方法檢測兩種培養(yǎng)方法處理后的人肝癌細胞株SMMC-7721腫瘤細胞中腫瘤干細胞表面標志CD90、CD133、CD24對應的mRNA表達水平的變化情況。
　　5、將兩種培養(yǎng)方法處理后的人肝癌細胞株SMMC-7721腫瘤細胞各自注射入不同的裸鼠皮下，觀察并記錄種植瘤的體積，依此比較兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤細胞的致瘤能力及體內(nèi)增殖能力。
　

3、　結(jié)果:
　　1、兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤細胞形態(tài)學變化。
　　倒置顯微鏡下觀察到貼壁培養(yǎng)的SMMC-7721腫瘤細胞呈鋪路石樣生長，排列規(guī)整。而懸浮培養(yǎng)后SMMC-7721腫瘤細胞逐漸由單細胞聚集、增殖成球狀或類球狀。
　　2、應用流式細胞儀檢測兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤干細胞表面標志CD90、CD133、CD24的各自表達量比較。
　　結(jié)果顯示:懸浮培養(yǎng)組中CD90(571.77±8.70)、CD24(233.56

4、±10.85)的表達量明顯高于貼壁培養(yǎng)組(19.15±0.54、17.37±0.15)，差異有統(tǒng)計學意義(CD90 t=-109.80 P=0.00; CD24 t=-34.51 P=0.00)，但CD133在懸浮培養(yǎng)組(1.42±0.61)與貼壁培養(yǎng)組(1.48±1.09)中的表達量差異無統(tǒng)計學意義(t=0.08 P=0.94)。
　　3、兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤干細胞表面標志CD90、CD133、CD24對應的mRNA表達水平的

5、變化情況。
　　3.1 RNA的鑒定
　　紫外線下觀察可見有兩條明亮的條帶，分別對應于28S和18S RNA，另外有一條較暗淡的5S條帶。28S和18S條帶的光密度值之比約為(1.5～2)∶1，并且未見RNA彌散帶，表明RNA完整性良好。
　　3.2mRNA相對表達結(jié)果
　　Real-Time PCR結(jié)果顯示，CD90、CD24、CD133基因均有擴增，擴增曲線均進入平臺期，熔解曲線呈標準的單峰，無雜峰出現(xiàn)，表明

6、擴增產(chǎn)物特異。若貼壁培養(yǎng)組mRNA的表達量設定為1，則懸浮培養(yǎng)組的CD90、CD24、CD133mRNA相對表達量分別為1.72±0.19、1.72±0.19、1.05±0.03。兩組相比，懸浮培養(yǎng)后細胞的腫瘤表面標志物CD90、CD24的mRNA相對表達量明顯高于貼壁培養(yǎng)組，差異具有統(tǒng)計學意義(CD90 t=-6.55 P=0.02，CD24 t=-6.71 P=0.00)，而貼壁培養(yǎng)組的CD133mRNA表達量相比懸浮培養(yǎng)組的無明顯

7、差異(t=-3.41 P=0.08)。
　　4、比較兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤細胞致瘤性及體內(nèi)增殖能力。
　　根據(jù)隔天測量皮下注射兩種方法培養(yǎng)的SMMC-7721的裸鼠腫瘤長(a，單位mm)、寬(b，單位mm)，按ab2/2計算出的體積(V，單位mm3)大?。ㄙN壁培養(yǎng)組腫瘤細胞裸鼠皮下注射后2天:71.23±51.44，4天:60.08±24.33,6天:45.14±15.24,8天:32.56±10.16,10天:31.73±

8、7.01，12天:26.41±13.95，14天:26.95±14.14;懸浮培養(yǎng)組腫瘤細胞裸鼠皮下注射后2天:60.17±47.93，4天:41.09±19.37，6天:32.90±14.13,8天:74.87±27.54,10天:97.30±37.63,12天:209.06±138.40，14天:294.69±250.65)，統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示兩組間差別有統(tǒng)計學意義(F=11.76，P=0.01)，說明兩組皮下腫瘤致瘤性及體內(nèi)增殖能

9、力有差別。而測量時間與培養(yǎng)方式之間存在交互作用(F=6.18，P=0.03)，隨著測量時間的延長，懸浮培養(yǎng)組所致的皮下腫瘤體積變化趨勢呈從開始注射后2天到注射后6天為減小(2天:60.17±47.93，4天:41.09±19.37，6天:32.90±14.13)，6天后大幅增高(8天:74.87±27.54，10天:97.30±37.63,12天:209.06±138.40,14天:294.69±250.65),貼壁培養(yǎng)組皮下腫瘤體積變

10、化趨勢則呈緩慢減小后趨于穩(wěn)定的趨勢（2天:71.23±51.44,4天:60.08±24.33,6天:45.14±15.24,8天:32.53±10.16,10天:31.73±7.01,12天:26.41±13.95,14天:26.95±14.14)。說明懸浮培養(yǎng)的腫瘤細胞在裸鼠體內(nèi)的增值能力強于貼壁培養(yǎng)的。且貼壁培養(yǎng)組編號4的裸鼠在皮下注射腫瘤細胞14天內(nèi)皮下腫瘤體積逐漸縮小至未觸及，結(jié)果提示懸浮培養(yǎng)組比貼壁培養(yǎng)組致瘤性更強。

11、　　結(jié)論:
　　1、懸浮培養(yǎng)后人肝癌細胞株SMMC-7721部分細胞獲得了與腫瘤干細胞相似的部分特性，即為肝癌干細胞樣細胞。
　　2、經(jīng)過懸浮培養(yǎng)的人肝癌細胞株SMMC-7721腫瘤細胞中表達肝癌干細胞樣細胞表面標志物CD90、CD24的量明顯比貼壁培養(yǎng)的腫瘤細胞多，且所對應的mRNA相對表達量也是相應增高的。但CD133及其對應的mRNA表達效果在兩種培養(yǎng)方法的腫瘤細胞中無明顯差別。因此，懸浮培養(yǎng)后的人肝癌細胞株SMMC-