血凝和血凝抑制實驗

1、血凝和血凝抑制實驗,,內(nèi)容,一、重要性二、檢測內(nèi)容和方法三、血凝和血凝抑制試驗,一、重要性,動物免疫接種已經(jīng)成為目前防御疫病傳播的首選措施，只有給動物進行有效的免疫接種后， 才能在產(chǎn)生一定的保護力， 從而防止疫病的侵入和蔓延。因此在畜禽生產(chǎn)過程中, 在群體接種疫苗前后對抗體水平進行檢測， 準確了解動物疫病發(fā)生、 傳播和流行情況，掌握全市畜禽規(guī)模養(yǎng)殖場的免疫抗體水平和動物疫病保護情況， 從而更有效地采取綜合防控措施。因此，做好動物免

2、疫抗體檢測工作有著十分重要的臨床意義和經(jīng)濟意義。,,,,,,一、重要性,,,,,,二、檢測內(nèi)容和方法,檢測內(nèi)容,,,,,,二、檢測內(nèi)容和方法,檢測方法,血凝試驗：某種病毒的血凝素，能使雞、鵝或人的紅細胞發(fā)生凝集，叫做血凝試驗，也稱直接血凝反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計的試驗稱血凝試驗 (HA) 。常見于正粘病毒、副粘病毒和某些黃病毒、痘病毒等。 目的：測定病毒的血凝效價，采用一定的病毒量，通常采用4個血凝單位,用已知抗原來檢測被檢血清中

3、有無相應(yīng)的特異性抗體和滴定該特異性抗體的水平。,三、血凝與血凝抑制實驗（禽流感和雞新城疫）,刺突：亞型特異性抗原，易變異,血凝素（HA，從H1—H15):呈柱狀 功能：①吸附細胞：與細胞上受體結(jié)合,使病毒　　　　　　　侵入細胞②凝集多種動物的紅細胞（血凝試驗）③具抗原性：其抗體能中和病毒---中和抗體 　抑制血凝（血凝抑制試驗）,血凝抑制試驗：當病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆粒

4、或其血凝素，則紅細胞表面的受體就不能與病毒顆粒或其血凝素直接接觸。這時紅細胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為紅細胞凝集抑制反應(yīng)，也稱血凝抑制反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計的試驗稱血凝試驗 (HI) 。該試驗是目前WHO進行全球流感監(jiān)測所普遍采用的試驗方法。 目的：檢測實驗用雞群有無病毒感染和監(jiān)測雞的免疫狀態(tài)。,三、血凝與血凝抑制實驗（禽流感和雞新城疫）,血凝試驗（HA)原理：,,血凝抑制試驗（HI）原理 病毒的懸液中加入特

5、異性抗體，紅細胞的凝集現(xiàn)象被抑制，稱為紅細胞的血凝抑制。,？,,,+,,主要實驗器材：,微量移液器,○普通離心機,微量振蕩器,禽用采血器,96孔血凝反應(yīng)板,試驗主要試劑：,標準抗原、陽性血清、陰性血清與待檢血清1%雞紅細胞懸液（阿氏液）四單位抗原生理鹽水（PBS液）,阿氏（Alsevers）液配制稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69

6、kPa 15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?1%紅細胞的配制：,1.為避免有些雞只的紅細胞有自凝現(xiàn)象，因此配制1%紅細胞懸液時應(yīng)最好選擇采取3只SPF雞或未進行過任何免疫過的成年公雞血液。（抗凝劑與血液比例為1:4）2.采血完畢后將血加入至10ml離心管中，加3-4倍體積生理鹽水以2000~3000r/min，5~10min離心3-5次。3.棄去上液和紅細胞上層的白細胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液，上下緩慢顛倒（切忌用力過大使

7、紅細胞破裂），使其充分混勻，再離心棄去上清液，反復幾次直至上清液清亮透明為止。,4.吸取壓積紅細胞泥與生理鹽水以1:99進行配制1%雞紅細胞懸液。5.在加紅細胞過程中還須不斷輕搖以確保紅細胞均勻，使其每孔加入相同數(shù)量的紅細胞。6.制備好的紅細胞液如果放置后上清液變紅，說明有溶血，不可再使用。,四、血凝試驗操作步驟,,倒加,血凝試驗操作步驟,4個100%血凝單位（即4HA100）抗原的稀釋倍數(shù)=使100%紅細胞凝集的抗原最高稀釋倍數(shù)

8、/4,結(jié)果判定1.在各組對照均正確的情況下，按下列標準判定 血凝反應(yīng)強度示意圖“4＋” 紅細胞呈片狀凝集，均勻布滿孔底，邊緣有時不整齊或皺縮?！?＋” 紅細胞呈片狀凝集，但面積略小于“4+”?！?＋” 紅細胞呈片狀凝集，但有少許沉積孔底中部呈小圓點狀?！埃?紅細胞大部分沉于孔底中央，周圍有少量散在凝集顆粒?！埃?紅細胞均沉于孔底呈小圓點狀，邊緣整齊。2.對照孔

9、正常的情況下，紅細胞凝集100%的稀釋度為判定血凝價的終點。凡能使雞紅細胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)為病毒的凝集價。,,四單位抗原是血凝抑制試驗的重要環(huán)節(jié)，其準確性對試驗結(jié)果有重要的影響。抗原濃度高時，HI抗體效價就會降低；反之則會有所升高?？乖r測量是否準確，決定了配制而得的四單位抗原準確性。,血凝抑制試驗操作步驟,血凝抑制試驗結(jié)果判定：,以完全抑制紅細胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴度（注：看結(jié)果時96孔板傾斜45度）。注