正向間接血凝試驗

1、正向間接血凝試驗,省疫控中心周迎春,主要內容,背景原理實驗器材的優(yōu)化試劑的優(yōu)化樣品的優(yōu)化實驗過程優(yōu)化判定標準注意問題,一、背景,正向間接血凝試驗(IHA)是上世紀 60 年代在我國發(fā)展起來的血清學診斷技術，是一種用已知抗原檢測未知抗體的試驗方法，它的操作方法相對簡單，實驗原理也易于理解，在基層實驗條件和技術相對落后的情況下經常被應用到，在一些動物疫病的免疫抗體檢測、疫病診斷上具有現(xiàn)實意義。林琳等研究表明應用豬瘟正向間接

2、血凝法(IHA)與斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（dot- ELISA）以及豬瘟抗體免凝金標試紙條比較，對規(guī)?；B(yǎng)豬場 138份不同階段豬血清進行檢測，三種方法檢測抗體的陽性率結果接近。,一、背景,數(shù)十年來正向間接血凝試驗技術不斷完善，它具有簡單、經濟、快速、實用的特點，在我國有很大的用戶群，近年來，蘭州獸醫(yī)研究所生產的液體豬瘟和口蹄疫正向間接血凝試驗的試劑用量在逐年加大。然而，正向間接血凝作為一種微量的定量反應試驗，實驗結果受操作技術影響較大，

3、任何操作環(huán)節(jié)的紕漏都會使最后判定的結果與正確結論大相徑庭。為規(guī)范操作，本次培訓就實驗中器材、試劑、樣品、過程和判定標準等方面的優(yōu)化做一綜述，以期作為此實驗的借鑒。,二、原理,正向間接血凝試驗的原理是將可溶性抗原吸附于與免疫無關的載體（紅細胞）表面，此吸附抗原的紅細胞與相應的抗體結合，在有電解質存在的適宜條件下發(fā)生的肉眼可見的凝集性反應。,二、原理,充分理解正向間接血凝試驗的原理，對整個試驗的操作和結果判定都具有很大的指導意義。,三、實

4、驗器材的優(yōu)化,本實驗所使用的實驗器材包括微量血凝板，微量振蕩器，移液器和吸頭，為保證實驗的順利進行，要選擇質量有保障，穩(wěn)定性好的器材。,三、實驗器材的優(yōu)化,1、微量血凝板實驗室經常使用的是有機玻璃材質 或者一次性的110°底角的 96 孔 V 型微量血凝板。有機玻璃板板可以疊放，不占實驗室臺面，處理樣品量較大時合適，但每次用完需要清洗。清洗方法：一般先用清水浸泡，然后馬上用高壓清水沖洗，洗凈后用手甩干板子倒置于37℃溫箱中烘

5、干。用前要先檢查血凝板孔底是否干凈，如發(fā)現(xiàn)有透光性差一點的孔，可用酒精棉簽擦凈。除了有機玻璃板以外，還有一次性血凝板，不需清洗，也不用擔心板子不干凈影響結果，但不能疊放，測定少量樣品適合。,三、實驗器材的優(yōu)化,2、 微量振蕩器使用振蕩器振蕩時間不宜超過 10 秒鐘，振蕩強度不能太大，先從小到大，中等強度即可。多塊板疊加后振蕩時要用手壓住最上一板，以防上下的振動造成孔中液體濺出而影響實驗結果的準確性。如果實驗室沒有它，也可用手輕拍血凝板

6、的邊緣即可。,三、實驗器材的優(yōu)化,3 、單、多道微量移液器建議使用高質量的移液器，用定量移液器需要準備 50 微升和 25 微升兩種。50 微升的用來加稀釋液和稀釋血清，25 微升的用來加血凝抗原。可調的移液器要選擇與檢測過程中加樣量相近量程的移液器，吸取液體時動作要輕緩，防止溶液吸入過快，沖入移液器污染柱塞或造成堵塞漏氣。一定要養(yǎng)成移液器用完后放在移液器架上的習慣，移液器如果掉到地下很容易損壞。用完后移液器用 75%的酒精棉擦拭，并

7、把刻度調到最大值。,三、實驗器材的優(yōu)化,4、 吸嘴高質量的吸嘴經過處理后可以重復使用。處理方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂洗，用超聲波清洗器處理10分鐘，換水后用二層紗布包好，用洗衣機甩干，再用超聲波清洗器處理 10 分鐘，再用洗衣機甩干，高壓消毒滅菌器中 121℃，20分鐘即可，去蓋放 37℃溫箱中烘干。吸嘴用完后沒有用清水浸泡的很難洗干凈，不必重復使用。接觸過高感染性材料的吸嘴要高溫消毒后廢棄。經過處理后的吸嘴如果尖頭變彎

8、，則質量不好，不要重復使用。,四、試劑的優(yōu)化,1、 抗原液體正向血凝抗原搖勻后呈咖啡色，無塊狀物沉淀，靜置后血球逐漸沉入瓶底。搖勻后能很快形成均勻混懸液的是好抗原，搖勻后仍有小塊黑色沉淀物（血球團）的抗原建議不要使用。如果只做篩檢看是否達到合格線，一瓶抗原可以檢測 30 到 50 份血清。值得一提的是液體正向血凝抗原 4~8℃保存，保存期3個月，不能冷凍保存。,四、試劑的優(yōu)化,2、對照血清陰性對照血清呈淡黃色清亮液體，陽性對照血清微

9、紅或淡黃色略微混濁的液體。陰陽性對照血清可在- 15℃到 - 20℃保存，有效期 1 年。3 、稀釋液稀釋液無色透明，一般情況 4~8℃保存。用前建議將稀釋液放 室溫或37℃溫箱中半小時后搖勻再用較好。試劑不能放置太久，最好新進現(xiàn)用。,五、樣品血清的優(yōu)化,新分離血清盡快檢測完，未檢血清 - 20℃保存。冷凍血清待檢時需融化，同時避免血清反復凍融影響檢測結果。嚴重溶血、嚴重污染、腐敗或有懸浮雜質的血清樣品不宜檢測，以免發(fā)生非特異性反應

10、。,六、實驗過程優(yōu)化,正向血凝實驗過程包括：加稀釋液，稀釋待檢血清，稀釋陰性、陽性血清，加血凝抗原，震蕩靜置，結果判定。在試驗中要注意以下的問題：1、加稀釋液在血凝板上1~6 排的 1~9 孔；第 7 排的 1~4孔，第6-7孔；第 8 排的 1~12 孔各加稀釋液 50 微升。,六、實驗過程優(yōu)化,2、稀釋待檢血清取1號待檢血清 50 微升加入第 1 排第 1 孔，并將槍頭插入孔底，混勻后，從該孔吸取 50 微升移入第 2 孔，混

11、勻后從該孔吸取 50 微升移入第 3 孔直至第 9 孔。此時第 1 排 1~9 孔待檢血清的稀釋度（稀釋倍數(shù)） 依次為 1∶2、1∶4、1∶8……1∶256、1∶512。每個待檢血清樣品均按上述方法稀釋，每稀釋一份血清要換吸嘴。每次滴加樣本后應吸取稀釋液并沖洗幾次，最后將滴頭內的殘液完全排盡，以盡可能的保證樣品被全部加入反應孔。作倍比稀釋前，應且記將滴頭內的空氣排盡，避免稀釋時孔內產生氣泡，直接影響結果判定。,六、實驗過程優(yōu)化,3、稀釋

12、陰性對照血清在血凝板上的第 7 排第 1 孔加陰性血清 50 微升，對倍稀釋至第4 孔。此時陰性血清的稀釋倍數(shù)依次為 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16。第 6-7孔為稀釋液對照孔。,六、實驗過程優(yōu)化,4、稀釋陽性對照血清在血凝板上的第 8 排第 1 孔加陽性血清 50 微升，對倍稀釋至第 12 孔。此時陽性血清的稀釋倍數(shù)依次為 1∶2、1∶4、1∶8……1∶2048、1∶4096。每次試驗要做陰陽性對照，最好也做二孔空白對照，即孔

13、中加 50 微升稀釋液后加25 微升抗原。每次檢測時陰性、陽性和稀釋液對照只需各做一份。,六、實驗過程優(yōu)化,5、加血凝抗原被檢血清各孔、陰性對照各孔、陽性對照各孔、稀釋液對照孔均各加血凝抗原 25 微升。血凝抗原用前要充分搖勻，瓶底應無血球沉淀。一次實驗過程應選擇同一批號的抗原，并先從稀釋度高的孔加起，避免滴頭和孔內的液體直接接觸。,六、實驗過程優(yōu)化,6、振蕩混勻將血凝板置于微量振蕩器上振蕩 10 秒鐘，如無振蕩器，用手輕輕搖勻即可

14、。然后將血凝板放在白紙上觀察各孔紅血球是否混勻，以沒有血球沉淀為合格。蓋上玻板，室溫下或 37℃下靜置 2 小時，判定結果，也可將板置冰箱中冷藏延至次日判定。,七、判定標準,將血凝板放在白紙上，先觀察陰性對照血清1∶16孔和稀釋液對照孔，均應無凝集（血球全部沉于孔底形成邊緣整齊的小圓點），或僅出現(xiàn)“+”凝集（血球大部分沉于孔底，邊緣稍有少量血球凝集）。陽性對照血清 1∶2 到 1∶256 各孔（1~8 孔）應出現(xiàn)“++”到“++++”凝

15、集為合格（少量血球沉于孔底，大部分血球凝集）。如圖 1 所示，該陽性血清滴度為1∶512 倍或記為 9log2。,七、判定標準,在對照孔合格的前提下，觀察待檢血清各孔，以呈現(xiàn)“++” 凝集的最大稀釋倍數(shù)為該份血清的抗體效價。因此正確識別“++”的凝集現(xiàn)象是最后結果判定的先決條件。一般的判定方法是將血凝板放在白紙上，在各對照孔符合要求的前提下，從開始出現(xiàn)沉淀的孔觀察起，至血球全部沉淀孔，綜觀這幾孔，前后對比血球凝集和沉淀的發(fā)展情況，以1/

16、2血球沉淀孔的血清稀釋倍數(shù)為該份血清的效價。,七、判定標準,附：血凝試驗強度,七、判定標準,例如 1 號待檢血清1~5孔呈現(xiàn)“++”到“++++”凝集，6~7 孔呈現(xiàn)“++”凝集，第8孔呈現(xiàn)“+”凝集，第 9 孔不凝集，那么就可判定該份血清的抗體效價為 1∶128，或者說 7log2。接種口蹄疫和豬瘟疫苗的畜群免疫抗體效價達到1∶32（即 5log2；第 5 孔）呈現(xiàn)“++”凝集為免疫合格。,八、注意問題,1、鑒于有些場豬瘟間接血凝試驗

17、的樣品與 ELISA 方法相比符合率不一致，不少學者認為是牛病毒性腹瀉抗體的干擾導致的，提出了間接血凝方法雖然簡單，但不能區(qū)分豬瘟抗體與牛病毒性腹瀉抗體。在實驗中如果遇到這種情況，建議采用豬瘟抗體單抗阻斷ELISA 方法進行檢測，其結果更可靠些。,八、注意問題,2、血凝板的孵育時間和判定試劑盒要求使用 110°底角的血凝板，判讀結果時間應在 2 小時后為妥，冬天還可適當長一點，低于 1.5 小時會判斷不準。 血凝板第 4 孔