檢測豬乙腦抗體的EDⅢ抗原間接ELISA與血凝抑制和蝕斑減少中和試驗(yàn)的相關(guān)性研究.pdf

1、日本腦炎（Japaneseencephalitis，JE）又稱流行性乙型腦炎，簡稱乙腦，是一種經(jīng)蚊子傳播的，由黃病毒科黃病毒屬的日本腦炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）引起的人畜共患病。人和馬的乙型腦炎臨床特征是發(fā)熱和腦炎，豬乙型腦炎主要表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)和公豬睪丸炎。豬感染JEV后病毒血癥持續(xù)時間長，滴度高，是JEV在自然界的擴(kuò)增宿主。目前沒有針對JE治療的特效藥，預(yù)防性疫苗接種是防控該病的主要措施之一。

2、因此，對JEV易感動物群體的免疫狀態(tài)及時有效的監(jiān)測就顯得十分重要。JEV囊膜蛋白(EnvelopeProtein,E)結(jié)構(gòu)域Ⅲ(DomainⅢ，EDⅢ)是JEV主要結(jié)構(gòu)蛋白E蛋白上的抗原結(jié)構(gòu)域，能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生病毒特異性的體液免疫，在宿主抗JEV感染致病中起重要作用。血凝抑制試驗(yàn)(HemagglutinationInhibitiontest，HI)和蝕斑減少中和試驗(yàn)（PlaqueReductionNeutralizationTest，PR

3、NT）是檢測JEV抗體的經(jīng)典方法。但是因?yàn)檫@些檢測方法對試驗(yàn)材料、操作者的熟練度和特殊設(shè)備的依賴而在臨床的廣泛應(yīng)用受到限制，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是目前檢驗(yàn)常用的免疫學(xué)檢測方法之一，主要因?yàn)槠洳僮骱唵危瑱z測快速，敏感性、特異性強(qiáng)，檢測量大。但是ELISA檢測結(jié)果的臨床意義評價需要大量相關(guān)流行病學(xué)數(shù)據(jù)來支持。因此，本研究在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上對檢測JEV抗體的間接ELISA檢測方法進(jìn)行完善，對比檢測臨床血清樣品，分析間接ELIS

4、A結(jié)果與HI以及PRNT檢測結(jié)果的相關(guān)性，從而為建立JEVEDⅢ抗原間接ELISA提供臨床意義的評價指標(biāo)，為JEV抗體ELISA試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.原核表達(dá)乙腦病毒EDⅢ抗原進(jìn)行間接ELISA的研究
　　本試驗(yàn)室構(gòu)建保存的pET-28a-EDⅢ的BL21甘油茵，經(jīng)表達(dá)條件優(yōu)化，EDⅢ蛋白在大腸桿菌中IPTG低溫誘導(dǎo)，呈可溶性表達(dá)，但是表達(dá)量低;37℃誘導(dǎo)表達(dá)EDⅢ可呈包涵體表達(dá)，以包涵體形式大量

5、存在。通過His標(biāo)簽親和層析柱分離純化，得到較純的EDⅢ蛋白，經(jīng)三次表達(dá)純化，測得平均蛋白濃度為2.84mg/mL，平均每升菌液可得9.4mg純化的蛋白。用Westenblot分析所表達(dá)的蛋白可以與JEV陽性抗體特異性反應(yīng)，表明包涵體表達(dá)的EDⅢ蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可作為包被抗原。用純化的EDⅢ蛋白作為包被抗原，對各項(xiàng)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了檢測JEV抗體的間接ELISA方法。確定ELISA的最佳反應(yīng)條件如下，包被濃度0.7μg/m

6、L，4℃過夜;1％BSA的PBST4℃封閉過夜;待檢血清稀釋度為1∶40，37℃作用1h;二抗1∶5000(0.2μg/mL)稀釋，37℃作用1h。陰陽性判斷，以O(shè)D450nm≥0.436判定為陽性，OD450nm≤0.363為陰性，中間值為可疑，復(fù)檢仍為可疑值時判定為陰性，即OD450nm＜0.436即判定為陰性。通過特異性試驗(yàn)表明與藍(lán)耳病，豬瘟，偽狂犬病等的陽性血清OD45nm值低，無交叉反應(yīng)。批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)效果較好。此方法具

7、有良好的特異性、重復(fù)性和敏感性。
　　2.乙腦病毒EDⅢ抗原間接ELISA與血凝抑制及蝕斑減少中和試驗(yàn)的相關(guān)性研究
　　用間接ELISA檢測127份豬血清中JEV抗體，再對其進(jìn)行HI效價測定，最后對其中21份進(jìn)行PRNT，以測定其中和效價。經(jīng)配對卡方檢驗(yàn)表明，HI對ELISA的靈敏度為72.5％，特異度為52％，兩種方法的符合率為68.5％，兩種檢測方法差異不顯著(X2=5.535，P=0.17＞0.05);PRNT對HI試

8、驗(yàn)的靈敏度為72.2‰特異度為33.3％，兩種方法判定的符合率為66.7％，差異性不顯著(X2=0.039，P=0.453＞0.05);PRNT對ELISA的敏感度為80.0％，特異度為50.0％，兩種方法判定的符合率為71.4％，差異不顯著(X2=1.890，P=1＞0.05)。說明此三種檢測方法都能有效檢測豬血清中的乙腦抗體水平，但是ELISA檢測更為敏感。
　　3.豬血清乙腦抗體的流行病學(xué)調(diào)查
　　為更好地了解不同免疫

9、背景的豬血清中乙腦抗體水平，用建立的乙腦病毒EDⅢ抗原間接ELISA方法，對339份不同乙腦疫苗免疫的豬血清，以及安徽、江蘇不同規(guī)模豬場采集的不同免疫背景的豬血清進(jìn)行檢測分析。并對不同地區(qū)、不同規(guī)模豬場以及不同免疫程序的豬血清中乙腦抗體流行情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，乙腦抗體流行按照豬場所在地區(qū)、豬場規(guī)?；潭纫约懊庖叱绦?，呈現(xiàn)一定的規(guī)律性;其次也表明所建立的EDⅢ抗原間接ELISA能真實(shí)反應(yīng)乙腦抗體水平，為后續(xù)乙腦抗體檢測試劑盒的研制提供