白癜風(fēng)血清相關(guān)因子的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選鑒定和致病作用研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)擬提出如下問(wèn)題:白癜風(fēng)的穩(wěn)定期和進(jìn)展期的是否有相關(guān)蛋白質(zhì)存在差異？我們預(yù)采用兩種不同的蛋白質(zhì)組學(xué)2-DE和iTRAQ來(lái)分別檢測(cè)白癜風(fēng)不同分期與健康對(duì)照組之間的差異蛋白進(jìn)行比較分析，及其網(wǎng)絡(luò)互作的關(guān)系找出新的通路，根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)篩選出的高富集因子進(jìn)行功能學(xué)驗(yàn)證與蛋白質(zhì)組學(xué)的表達(dá)是否一致，并且能否篩選出有意義的因子作為血清生物標(biāo)志物？通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)篩選和臨床總結(jié)進(jìn)一步提出一個(gè)假說(shuō):帶狀皰疹病毒能否成為誘因作為抗原肽段

2、通過(guò)T淋巴細(xì)胞識(shí)別發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起黑色素細(xì)胞的脫失導(dǎo)致白癜風(fēng)？為解決上述問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)首先利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選鑒定出白癜風(fēng)的不同分期的差異蛋白，分析出新的分子功能和通路;其次進(jìn)一步行白癜風(fēng)血清中的功能性驗(yàn)證以找到血清標(biāo)志物。最后根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)篩查的分子機(jī)制對(duì)帶狀皰疹病毒是否能作為T(mén)淋巴細(xì)胞識(shí)別抗原的誘因進(jìn)行探討，為研究白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制找到新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　一、2-DE雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)組學(xué)篩選
　　采用雙

3、向凝膠電泳技術(shù)篩選白癜風(fēng)不同分期可能相關(guān)的血漿差異蛋白。白癜風(fēng)穩(wěn)定期和進(jìn)展期各10例與正常組10例分為三組，等量混合不同研究組別的血漿樣品，并采用Clean-Up試劑盒進(jìn)行預(yù)處理后，測(cè)定樣品蛋白濃度，用雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，凝膠經(jīng)過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色后進(jìn)行凝膠圖像分析。膠內(nèi)酶解差異蛋白點(diǎn)，并串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。
　　二、iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選
　　收集白癜風(fēng)患者穩(wěn)定期和進(jìn)展期血清各10例與正常對(duì)照組血清10例，提蛋白后去除

4、高峰量蛋白，然后用trypsin進(jìn)行蛋白酶裂解、烷基化、酶解得到肽段。用iTRAQ試劑多重標(biāo)簽標(biāo)記肽段，混合后運(yùn)用離子交換柱分離，最后用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定得到差異蛋白。最后通過(guò)Uniprot和Cytoskpe軟件進(jìn)行生物網(wǎng)絡(luò)分析，預(yù)測(cè)差異蛋白在生物網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)系。
　　三、白癜風(fēng)不同分期相關(guān)差異蛋白的Westernblot的表達(dá)驗(yàn)證
　　選擇高富集細(xì)胞因子SERPINA5（共同上調(diào)）、LUZP4（共同下調(diào)）和脂

5、質(zhì)相關(guān)蛋白PON1及APO（載脂蛋白L1和載脂蛋白E），收集白癜風(fēng)共40例樣本分為穩(wěn)定期和進(jìn)展期2組和正常組20例進(jìn)行westernblot蛋白水平驗(yàn)證，按照蛋白提取法提取血清中蛋白;BCA檢測(cè)蛋白濃度;經(jīng)制膠、跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗、ECL顯色并拍照，觀察蛋白表達(dá)變化。
　　四、白癜風(fēng)不同分期相關(guān)差異蛋白Elisa的蛋白水平驗(yàn)證
　　進(jìn)一步驗(yàn)證高富集細(xì)胞因子SERPINA5進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，收集58例白癜風(fēng)穩(wěn)定期

6、和進(jìn)展期樣本分為兩組和對(duì)照組30例，按照抗原包被、封閉反應(yīng)、依次加入待測(cè)血清樣本、酶標(biāo)抗體及底物，最后終止液顯色，上機(jī)檢測(cè)吸收比值的變化。
　　五、白癜風(fēng)進(jìn)展期患者的HLA SBT的分型
　　對(duì)80例白癜風(fēng)進(jìn)展期患者進(jìn)行HLA-A位點(diǎn)的分型，提取血液樣本的DNA，純化后OD260/280在1.7-1.9之間。擴(kuò)增基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)PCR產(chǎn)物，純化，測(cè)序反應(yīng)ABI3100。
　　六、兩種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)V

7、ZV抗原肽段
　　利用SYFPEITHI和BIMAS兩種表位預(yù)測(cè)軟件，對(duì)VZV抗原67個(gè)編碼基因在MHC結(jié)合位點(diǎn)A*0301上出現(xiàn)的頻率分析給予一定的分值，矩陣法按照分值大小進(jìn)行排序，在2％最高分的排序預(yù)測(cè)多肽中可找到最佳預(yù)測(cè)表位。
　　七、利用ELispot方法篩選帶狀皰疹病毒針對(duì)HLA-A3型白癜風(fēng)的陽(yáng)性抗原肽段
　　提取白癜風(fēng)的PBMC細(xì)胞與VZV陽(yáng)性肽段共孵育;用IFN-γ抗體包被，封閉和細(xì)胞激活前期準(zhǔn)備;洗板

8、，加入分泌性抗體和Streptavidin-HRP室溫孵育，洗板，顯色，Elispot計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)斑點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　一、兩種蛋白質(zhì)組學(xué)篩選白癜風(fēng)不同分期的差異蛋白表達(dá)
　　1、2-DE篩選白癜風(fēng)不同分期的差異蛋白表達(dá)
　　利用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選白癜風(fēng)不同分期的差異蛋白表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)共34個(gè)差異蛋白，其中白癜風(fēng)穩(wěn)定期與正常組相比，差異蛋白表達(dá)上調(diào)9個(gè)，下調(diào)6個(gè);進(jìn)展期與正常組相比

9、，差異蛋白表達(dá)上調(diào)8個(gè)，下調(diào)5個(gè);進(jìn)展期與穩(wěn)定期相比，差異蛋白表達(dá)上調(diào)5個(gè)，下調(diào)2個(gè)。差異蛋白在進(jìn)展期和穩(wěn)定期都有的高富集因子包括載脂蛋白APOE，補(bǔ)體C3、C4 C1q等，僅在進(jìn)展期篩選出的差異蛋白有過(guò)氧化物酶6，而進(jìn)展期與穩(wěn)定期比較的差異蛋白有甘露糖結(jié)合蛋白C，補(bǔ)體C4A和C4B。
　　2、iTRAQ篩選白癜風(fēng)不同分期的差異蛋白表達(dá)
　　利用同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量的蛋白質(zhì)組學(xué)（iTRAQ）篩選白癜風(fēng)不同分期的差異蛋白

10、共227個(gè)，其中穩(wěn)定期與正常組相比，差異蛋白表達(dá)上調(diào)42個(gè)，下調(diào)38個(gè);進(jìn)展期與正常組相比，差異蛋白表達(dá)上調(diào)56個(gè)，下調(diào)33個(gè);進(jìn)展期與穩(wěn)定期相比，差異蛋白表達(dá)上調(diào)23個(gè)，下調(diào)48個(gè)。其中，與正常組相比，白癜風(fēng)的不同分期篩選出的高富集因子包括絲氨酸蛋白酶抑制劑(SERPINA5)、亮氨酸拉鏈蛋白(LUZP4)、基質(zhì)蛋白酶(MMP9)和免疫球蛋白輕鏈重鏈等;而僅在白癜風(fēng)穩(wěn)定期篩選得到的高富集因子包括PLCH2、維生素D結(jié)合蛋白GC和PON

11、1;僅在進(jìn)展期篩選得到的高富集因子包括共激活蛋白(COTL1)、S100A9、S100A8、補(bǔ)體C9等。
　　3、分析白癜風(fēng)不同分期的差異蛋白所表達(dá)的四種功能。
　　與對(duì)照組相比，根據(jù)差異倍數(shù)＞1.5的標(biāo)準(zhǔn)分析得到:在穩(wěn)定期和進(jìn)展期白癜風(fēng)的差異蛋白所代表的分子功能除了免疫調(diào)節(jié)和氧化失衡等功能，還包括磷脂酰膽堿結(jié)合、絲氨酸蛋白酶抑制劑活化等發(fā)揮作用;另外還包括B細(xì)胞受體信號(hào)通路、吞噬作用、凝集素通路、內(nèi)源性免疫作用、纖維蛋白溶

12、解負(fù)調(diào)控等生物過(guò)程中的影響;細(xì)胞組分如補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)成分、IgA免疫球蛋白參與、細(xì)胞質(zhì)Ca2+的反應(yīng);還分析發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝、Syndecan-4通絡(luò)、FOXA2轉(zhuǎn)錄以及PPAR信號(hào)通路的富集作用等。而白癜風(fēng)的不同分期在分子功能上的區(qū)別包括穩(wěn)定期的低密度脂蛋白結(jié)合、蛋白多糖合成和進(jìn)展期的Toll樣受體4結(jié)合和花生四烯酸結(jié)合;在生物過(guò)程中的區(qū)別包括穩(wěn)定期表達(dá)的內(nèi)吞和Fc受體信號(hào)通路的吞噬以及進(jìn)展期的急性期免疫反應(yīng);而在通路富集的區(qū)別包括穩(wěn)定期

13、的PPAR信號(hào)通路和進(jìn)展期的amb2整合通路。
　　二、白癜風(fēng)不同分期的差異因子的蛋白水平驗(yàn)證
　　1、共同表達(dá)下調(diào)蛋白LUZP4蛋白水平的驗(yàn)證
　　60例樣本共分白癜風(fēng)穩(wěn)定期、進(jìn)展期和正常組共3組。
　　LUZP4:與正常組比較，差異蛋白下調(diào)最明顯的LUZP4的蛋白印跡表達(dá)結(jié)果表明，穩(wěn)定期和進(jìn)展期的蛋白表達(dá)強(qiáng)度降低與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。(P＜0.05)
　　2、共同表達(dá)上調(diào)SERPINA5蛋白水平的驗(yàn)證<

14、br>　　60例樣本共分白癜風(fēng)穩(wěn)定期、進(jìn)展期和正常組共3組。SERPINA5蛋白的驗(yàn)證結(jié)果表明:免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SERPINA5在穩(wěn)定期和進(jìn)展期的蛋白表達(dá)水平均降低，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果不一致但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步對(duì)SERPINA5蛋白進(jìn)行ELISA驗(yàn)證各28例樣本共分白癜風(fēng)穩(wěn)定期、進(jìn)展期和30例正常組共3組，3次重復(fù)結(jié)果。結(jié)果表明，與正常組相比，穩(wěn)定期的SERPINA5的蛋白濃度升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P＜0.05)

15、　　3、脂質(zhì)相關(guān)的差異蛋白驗(yàn)證
　　對(duì)脂質(zhì)相關(guān)差異蛋白PON1和APOE結(jié)果表明:與正常組相比，PON1和APOE在白癜風(fēng)穩(wěn)定期和進(jìn)展期的蛋白印跡反應(yīng)強(qiáng)度均降低，與蛋白質(zhì)組學(xué)篩查結(jié)果一致。且PON1在白癜風(fēng)進(jìn)展期的表達(dá)水平降低顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而與正常組相比，APOL1在白癜風(fēng)的穩(wěn)定期的蛋白印跡表達(dá)強(qiáng)度無(wú)明顯變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PON1和APOE之間并無(wú)相關(guān)性。
　　三、帶

16、狀皰疹病毒抗原肽段刺激CTL細(xì)胞免疫識(shí)別
　　1、VZV抗原陽(yáng)性肽段的篩選
　　選擇80例進(jìn)展期白癜風(fēng)患者中PCR檢測(cè)HLAA分型排名前三的HLA-A*0301，生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了VZV抗原的63條肽段。選擇12例A0301分型的進(jìn)展期白癜風(fēng)患者通過(guò)ELISOT方法篩選得到7個(gè)陽(yáng)性肽段，其中有2個(gè)強(qiáng)陽(yáng)性肽段Gp13(FVY-9 Tetramer)和Gp57(HVY-9 Tetramer)。
　　2、四聚體的功能學(xué)驗(yàn)證

17、
　　合成的兩個(gè)四聚體Gp13和Gp57與CD8+T淋巴細(xì)胞通過(guò)對(duì)HLA-A不同分型的進(jìn)展期白癜風(fēng)的檢測(cè)，得到Gp57的9肽頻數(shù)范圍在HLA-A*0301的進(jìn)展期白癜風(fēng)患者中占1％～3.6％之間，與非HLA-A*0301相比頻數(shù)升高;而激光共聚焦顯微鏡下觀察，兩組均可見(jiàn)雙標(biāo)陽(yáng)性的PBMC，呈非特異性。
　　結(jié)論：
　　1、首次將定量蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于白癜風(fēng)不同分期的血清標(biāo)志物的研究中，與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合，具有較高的準(zhǔn)確