人類胚胎干細(xì)胞-誘導(dǎo)型多潛能干細(xì)胞向功能成熟嗜酸性粒細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的:人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell,hESC)及人類多潛能干細(xì)胞(human pluripotent stem cell,hiPSC)具有無(wú)限增殖及多向分化潛能,它們的建立不僅為再生醫(yī)學(xué)研究提供豐富了的細(xì)胞來(lái)源,而且為建立疾病特異性模型,最終實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療提供了可能。目前已有報(bào)道在體外條件下從hES/iPS誘導(dǎo)分化出成熟血細(xì)胞,他們具有與外周血細(xì)胞相似的形態(tài)和功能。嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophil

2、)參與人體多種炎癥反應(yīng),從hES/hiPS誘導(dǎo)分化出成熟嗜酸性粒細(xì)胞目前尚未報(bào)道。本研究從hES/hiPS出發(fā),在體外條件下向功能成熟的嗜酸粒細(xì)胞誘導(dǎo)分化,并對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞形態(tài),表面及內(nèi)部顆粒蛋白表達(dá)水平,趨化游走及顆粒釋放功能等多方面進(jìn)行研究。為深入了解嗜酸性粒細(xì)胞早期分化,成熟過(guò)程并建立嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)的疾病模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法:選取hESC和hiPSC未分化集落分別與經(jīng)18Gyγ射線照射的小鼠主動(dòng)脈-性腺-中

3、腎區(qū)(Aorta—Gonad—Mesonephros,AGM)基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)2周,回收共培養(yǎng)細(xì)胞加入干細(xì)胞因子(SCF),白細(xì)胞介素3(IL-3),白細(xì)胞介素6(IL-6),Flt3配體(Flt3-ligand)等細(xì)胞因子進(jìn)行懸浮培養(yǎng)4周,每周對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù),May—Giemsa染色觀察細(xì)胞形態(tài),定期采用免疫熒光染色方法觀察成熟嗜酸性粒細(xì)胞表面標(biāo)記:嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶(Eosinophil Peroxidase EPO),主要鹼

4、性蛋白(Major Basic Protein MBP)及嗜鹼性粒細(xì)胞標(biāo)記2D7,ProMBP1(Pro—Major BasicProteinl)表達(dá)水平,通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)和RT—PCR方法觀察細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)部特異性抗原及顆粒蛋白基因表達(dá)水平,于懸浮培養(yǎng)第14,21天行透射電鏡檢查觀察嗜酸性粒細(xì)胞胞漿內(nèi)部特異性晶體結(jié)構(gòu),并進(jìn)行嗜酸性粒細(xì)胞功能檢測(cè),觀察hES來(lái)源嗜酸性粒細(xì)胞在不同濃度細(xì)胞因子作用下脫顆粒及趨化游走功能。
　　 結(jié)

5、果:研究結(jié)果表明,hES/AGMS3共培養(yǎng)2周即可產(chǎn)生少量EPO陽(yáng)性細(xì)胞,將此共培養(yǎng)細(xì)胞回收并進(jìn)行懸浮培養(yǎng)4周可以獲得大量高純度EPO+嗜酸性粒細(xì)胞,且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),EPO陽(yáng)性率表達(dá)逐漸升高,從懸浮培養(yǎng)第7天56.4％上升到第21天的94.4％,而嗜堿性粒細(xì)胞表面標(biāo)記2D7陽(yáng)性率表達(dá)從62.8％下降至25.7％,研究證明hES來(lái)源嗜酸性粒細(xì)胞早期發(fā)育經(jīng)歷一特定階段,此階段細(xì)胞同時(shí)表達(dá)嗜酸性粒細(xì)胞(EPO,MBP)和嗜堿性粒細(xì)胞(2D

6、7,ProMBP1)表面標(biāo)記,隨著細(xì)胞逐漸成熟嗜酸性粒細(xì)胞標(biāo)記明顯增加,而嗜堿性粒細(xì)胞標(biāo)記陽(yáng)性率逐漸減低。與外周血造血干細(xì)胞來(lái)源的嗜酸性粒細(xì)胞發(fā)育過(guò)程極為相似。流式細(xì)胞學(xué)觀察成熟嗜酸性粒細(xì)胞表面標(biāo)記Siglec-8表達(dá)水平,呈現(xiàn)時(shí)間依賴性模式(從液體培養(yǎng)第7天10.8％上升至21天91.3％),與EPO表達(dá)水平升高趨勢(shì)相一致。透射電鏡檢查分析,懸浮培養(yǎng)第21天透射電鏡下可見(jiàn)部分嗜酸性粒細(xì)胞特異性晶體結(jié)構(gòu),盡管此時(shí)晶體結(jié)構(gòu)尚未完全形成。細(xì)

7、胞功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn),hES來(lái)源的高純度成熟嗜酸性粒細(xì)胞在SIgA刺激下可釋放嗜酸性粒細(xì)胞特異性顆粒蛋白EDN(Eosinophil derivedneurotoxin),且嗜酸性粒細(xì)胞在fMLP,白細(xì)胞介素5(IL-5),嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(eoaxin)作用下具有趨化游走功能。我們采用同樣細(xì)胞培養(yǎng)方法,對(duì)四株正常人來(lái)源hiPS細(xì)胞與AGMS3進(jìn)行共培養(yǎng)-懸浮培養(yǎng),研究發(fā)現(xiàn)四株hiPS均可以產(chǎn)生數(shù)量不等的EPO陽(yáng)性嗜酸性粒細(xì)胞,其中201