小鼠誘導(dǎo)型多潛能干細(xì)胞對肝臟損傷后再生修復(fù)的影響.pdf

1、研究課題來源:
　　 本課題來源于國家973重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2010CB945502)。
　　 研究背景和目的、意義:
　　 誘導(dǎo)型多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，IPS cells)是指將體細(xì)胞重編程為具有多分化潛能的干細(xì)胞。這些干細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、表觀遺傳學(xué)、全基因表達譜以及特異的細(xì)胞類型分化潛能方面與ES細(xì)胞極為相似，而且解決了ES細(xì)胞在臨床應(yīng)用方面存在的免疫排

2、斥、來源有限及倫理問題，目前已通過實驗證明，將一定數(shù)量級的ips細(xì)胞移植到小鼠的生殖系統(tǒng)內(nèi)可發(fā)育為一個完整的個體，因此ips細(xì)胞是細(xì)胞治療以及組織器官再生領(lǐng)域最有前景的種子細(xì)胞之一。
　　 iPS細(xì)胞最先由Takahashi和Yamanaka在2006年通過利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在小鼠成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入了與多功能性有關(guān)的基因( Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)，利用多能性標(biāo)志分子Fbx15的表達對其轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進行篩選，最終

3、得到了具有胚胎干細(xì)胞某些特性的多功能干細(xì)胞，并命名為“誘導(dǎo)產(chǎn)生的多能性干細(xì)胞”。2007年7月，Yamanaka研究小組進一步利用Nanog代替Fbx15進行篩選，得到了Nanog+的iPS細(xì)胞系，這樣取得的iPS細(xì)胞更接近于胚胎干細(xì)胞。2008年以后，iPS技術(shù)發(fā)展非常迅速，科學(xué)家進一步改進和完善了該技術(shù)。鑒于c-Myc為原癌基因，導(dǎo)入c-Myc會使腫瘤發(fā)生率明顯增高，可能會阻礙其未來的臨床應(yīng)用，為了避免逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)致的致癌風(fēng)險，

4、山中伸彌實驗室和哈佛大學(xué)康拉德·霍克林格的實驗室于2009年成功地制備了非病毒整合鼠的ips細(xì)胞。此外，美國哈弗大學(xué)研究人員采取添加特殊化合物（如巴爾普羅酸）的方法，將體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的效率提高了100多倍。這些結(jié)果均提示了通過純化學(xué)物質(zhì)進行重組的可能性，這也為我們將來應(yīng)用ips細(xì)胞進行細(xì)胞治療提供了更安全、更具實用價值的技術(shù)平臺。
　　 iPS細(xì)胞技術(shù)的問世，使得一些遺傳性疾病或退行性疾病發(fā)展的病理學(xué)過程可在培養(yǎng)皿中進

5、行準(zhǔn)確觀察。近期，Park等利用iPS技術(shù)成功建立了10種人類遺傳性或退行性疾病起源的干細(xì)胞系，其中包括腺苷脫氨酶缺乏相關(guān)的重癥聯(lián)合免疫缺陷病(ADA-SCID)、亨廷頓病(HD)、帕金森病(PD)與青少年發(fā)生Ⅰ型糖尿病(JDM)等。與此同時，國內(nèi)外有大量的實驗及研究是關(guān)于ips細(xì)胞可在體外定向分化為某些具有特定功能的細(xì)胞，這些分化后的細(xì)胞可用于視網(wǎng)膜病變、耳蝸神經(jīng)方面、心血管疾病、腦神經(jīng)方面及糖尿病治療的研究。然而，目前關(guān)于ips細(xì)胞

6、在受損的活體肝臟內(nèi)是否可參與肝臟的再生修復(fù)以及如何參與再生的研究及報道甚少。國內(nèi)曾有學(xué)者通過在體外模擬體內(nèi)的生理條件，特異性的誘導(dǎo)ips細(xì)胞，成功地使得ips細(xì)胞遵循正常的發(fā)育路線定向分化為有功能的肝細(xì)胞，然而，該實驗并非真的在體內(nèi)進行，其次是成本極高，誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)量少，因此仍然難以證明ips細(xì)胞在體內(nèi)亦能定向分化為有功能的肝細(xì)胞，關(guān)于這一問題，國外的學(xué)者則通過體內(nèi)實驗，把ips細(xì)胞注入延胡索酰乙酰乙酸酶缺陷(fumaroylace

7、toacetate hydrolase，F(xiàn)AH)孕小鼠的胚胎，F(xiàn)AH小鼠因缺乏該酶可致酪氨酸血癥表現(xiàn)為進行性肝功能衰竭及腎小管壞死而很快死亡，實驗發(fā)現(xiàn)胚胎期注射了ips細(xì)胞來源的肝細(xì)胞的FAH小鼠出生后血清肝功能指標(biāo)及肝臟組織病理切片均正常，而未注射組的FAH小鼠出生后6周則出現(xiàn)肝功能衰竭，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞大量壞死，該實驗成功地證明了ips細(xì)胞來源的肝細(xì)胞在體內(nèi)可定向分化為有功能的肝細(xì)胞，但是該實驗移植所用的肝細(xì)胞是來源于完全由i

8、ps細(xì)胞發(fā)育成一個完整個體后的肝組織，因此，移植所用的細(xì)胞為成熟的有功能的肝細(xì)胞，該細(xì)胞為ips細(xì)胞在參與個體發(fā)育過程中分化產(chǎn)生的，并非直接研究ips細(xì)胞或者ips細(xì)胞來源的擬胚體(embryoid bodies，EBs)在受損的肝臟中是否可直接誘導(dǎo)為有功能的肝細(xì)胞，此外，該實驗的成本較前者實驗更高。
　　 因此，本實驗嘗試通過聯(lián)合運用D-氨基半乳糖(D-GaIN)、脂多糖(LPS)與肝臟部分切除術(shù)，建立較單純化學(xué)性肝損傷或單純

9、的肝部分切除術(shù)損傷程度更為嚴(yán)重、損傷范圍更為廣泛的小鼠急性肝損傷模型，將ips細(xì)胞來源的擬胚體（embryoid bodies，EBs）移植到該小鼠模型，通過觀察移植組與對照組小鼠血清肝功能指標(biāo)（谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及血清白蛋白）、ips細(xì)胞在體內(nèi)分布的指標(biāo)（綠色熒光蛋白，GFP）、ips細(xì)胞在體內(nèi)分化為功能性肝細(xì)胞的指標(biāo)（白蛋白與角蛋白18）等，探討ips細(xì)胞來源的EBs在該動物模型中是否可被定向誘導(dǎo)分化為有功能的肝細(xì)胞，從而參與肝

10、損傷后的肝臟再生。
　　 研究方法及內(nèi)容:
　　 一、實驗分組及小鼠化學(xué)性肝損傷模型建立將小鼠按隨機化原則均分為D-GaIN/LPS/肝臟部分切除組與肝臟部分切除組。D-G aIN/LPS/肝臟部分切除組:腹腔注射D-GaIN和LPS溶液，分別按500mg/kg，50μg/kg，先注射D-GaIN溶液，1h后注射LPS溶液;肝臟部分切除組:生理鹽水分別代替D-GaIN與LPS，注射方法同上。
　　 二、小鼠肝臟的

11、1/3切除第2次腹腔注射24h后，所有小鼠行肝臟1/3切除術(shù)。乙醚吸入麻醉，劍突下0.5～1.0 cm豎直切口，鈍性分離，用手術(shù)線從根部結(jié)扎左外葉并將其切除，將結(jié)扎端埋入腹腔，逐層縫合切口。
　　 三、肝臟體質(zhì)量比值、肝再生百分率計算小鼠的五葉肝臟中，左外葉占其肝臟總重35％～41％，因此，切除左外葉即可達到理論上的1/3肝切除。
　　 四、肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)及ips細(xì)胞在肝臟分布的觀察小鼠肝臟1/3切除術(shù)后第3、7和14天處

12、死小鼠并取出肝臟稱重，常規(guī)固定，石蠟包埋及切片。采用蘇木精-伊紅染色觀察肝細(xì)胞形態(tài)。移植后40d取移植組小鼠新鮮肝臟行冰凍切片，觀察ips細(xì)胞在體內(nèi)的分布情況。
　　 五、BrdU注射及BrdU、CK19、c-kit免疫組織化學(xué)檢測 BrdU注射:腹腔注射，按75mg/kg，共2次，每次間隔8h，最后1次注射24 h后處死動物并取肝臟。免疫組織化學(xué)染色按說明書操作，蘇木精復(fù)染（BrdU染色后經(jīng)蘇木精-伊紅復(fù)染），顯微鏡下觀察。應(yīng)

13、用Image-Pro plus6.0專業(yè)圖像分析軟件對染色陽性部位灰度值進行定量分析。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、兩組小鼠肝臟大體觀察及稱重結(jié)果，提示肝臟部分切除組術(shù)后第9天肝大體結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，肝質(zhì)量已接近術(shù)前值，第14天顏色、質(zhì)地已基本恢復(fù)正常，之后按正常生長規(guī)律增加，殘余肝臟代償增大，結(jié)扎部位增生組織顏色呈較淡黃色，未見新肝葉;而D-GaIN/LPS/肝臟部分切除組第14天肝質(zhì)量較術(shù)前仍偏小。
　　 2

14、、兩組小鼠肝部分切除后24h肝臟石蠟切片伊紅-蘇木精染色結(jié)果提示，D-GaIN/LPS/肝臟部分切除組術(shù)后肝竇和中央靜脈充血，庫普弗細(xì)胞（Kupffer's cell）增多;肝臟部分切除組小鼠肝臟僅有輕度的病理損傷。
　　 3、兩組小鼠在肝部分切除后各個時間點肝臟石蠟切片BrdU、C-kit與CK19染色結(jié)果提示，肝臟部分切除術(shù)后第7天，肝臟部分切除組小鼠肝內(nèi)可見大量散在分布BrdU陽性細(xì)胞，而D-GaIN/LPS/肝臟部分切除

15、組BrdU陽性細(xì)胞甚少。D-GaIN/LPS/肝臟部分切除組小鼠肝臟于術(shù)后第3天開始出現(xiàn)C-kit與CK18陽性的肝卵圓干細(xì)胞增生，從匯管區(qū)開始向肝小葉內(nèi)延伸以修復(fù)損傷，而肝部分切除組小鼠肝內(nèi)至第14天仍未見明顯C-kit與CK18陽性的細(xì)胞。
　　 4、D-GaIN/LPS/肝臟部分切除組小鼠在EBs肝臟定向移植后40天ALT、AST、ALB等肝功能指標(biāo)恢復(fù)正常，小鼠肝內(nèi)可見局灶狀分布的GFP陽性細(xì)胞，經(jīng)肝臟冰凍切片免疫熒光雙

16、染色可發(fā)現(xiàn)GFP和CK18雙陽性細(xì)胞。
　　 結(jié)論:
　　 1、成功建立了小鼠D-氨基半乳糖/L脂多糖/肝臟部分切除動物模型;
　　 2、D-氨基半乳糖與脂多糖對部分肝切除術(shù)后成熟肝細(xì)胞的再生具有顯著的抑制作用;
　　 3、小鼠D-氨基半乳糖/脂多糖/肝臟部分切除動物模型使得肝切后殘余的成熟肝細(xì)胞由于事先受到化學(xué)損傷而無法通過正常途徑再生，轉(zhuǎn)而刺激肝臟內(nèi)源以及外源的干細(xì)胞增殖、分化為成熟的肝細(xì)胞，進而修復(fù)