肺癌外周血EGFR基因突變高靈敏檢測方法的建立.pdf

1、前言：
　　近年來，我國肺癌的發(fā)病率與死亡率呈明顯上升趨勢，且起病隱匿，早期多無癥狀，約80％患者確診時已屬晚期，肺癌中達80%以上病理類型屬于非小細胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC），包括鱗癌、腺癌、支氣管肺泡細胞癌、腺鱗癌和大細胞癌等組織學類型，放化療后5年生存率仍低于20%。目前，表皮生長因子受體（epidermal growth fator receptor,EGFR）是國內(nèi)外已經(jīng)公

2、認的一個腫瘤靶向治療分子，早在2004年P(guān)aez和Lynch等發(fā)現(xiàn)EGFR突變是對小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor,TKI）敏感的一個強預(yù)測因子，目前發(fā)現(xiàn)EGFR中exon19（del E746-A750）和exon21（L858R）約占總突變的90%，又叫經(jīng)典突變或熱點突變，兩處熱點突變能夠增強腫瘤細胞對小分子酪氨酸激酶抑制劑的敏感性。因此，檢測EGFR基因的突變狀態(tài)在NSCLC治療中具有越來

3、越重要的意義。
　　目前癌癥檢測主要依賴于有創(chuàng)性組織病理活檢和細胞學檢查，但是臨床上肺癌患者多數(shù)為晚期往往難以取得腫瘤組織標本或不易重復獲取，更難于實時監(jiān)測。因此尋找腫瘤組織替代材料（如唾液、糞便、外周血等）用于基因診斷是當前迫切需要解決的問題，然而，這些樣品材料具有干擾成分多、肺癌標志物含量低等特性，且體細胞突變多為雜合突變，標本中突變基因所占比例通常較少。目前，臨床上常用突變檢測技術(shù)如PCR產(chǎn)物直接測序法、Taqman探針法、

4、突變特異性擴增系統(tǒng)(amplificationrefractory mutation system,ARMS)和高分辨率熔解曲線分析法(high resolutionmelting,HRM)等，敏感性都不夠高，大大限制了基因變異檢測在癌癥早期診斷方面的應(yīng)用。為此，需要探索一種新的更高靈敏度、更高特異性的EGFR基因突變檢測方法。
　　本論文是基于“973”課題（項目編號：2012CB933300）“基于納米技術(shù)的肺癌早期檢測研究”

5、和國家自然科學基金課題（項目批準號61271162）“高靈敏檢測肺癌外周血中EGFR基因突變的數(shù)字PCR芯片”的項目支持。博士課題階段，我們構(gòu)建了TaqMan-MGB雙探針熒光定量PCR檢測體系（TaqMan-MGB Dual-probe Real-time PCR/ TaqMan-MGB Dual Probes Fluorescence Real-time Quantitative PCR）和微流控芯片數(shù)字PCR檢測體系（Microf

6、luidic Chip Digital PCR）等，為便于以下敘述，分別簡記為qPCR和dPCR。鑒于外周血中腫瘤細胞產(chǎn)生的循環(huán)DNA量比較少、突變DNA分子更少的特點，通過制作含有納升級乳滴微反應(yīng)器的數(shù)字PCR芯片，將待測DNA分子分散到上萬個納升級的乳滴中，結(jié)合位點特異性擴增及TaqMan熒光探針，通過檢測每一乳滴的信號獲得EGFR突變情況，利用建立的EGFR基因突變檢測方法，研究外周血與組織標本EGFR基因突變的一致性，在此基礎(chǔ)上

7、探索一種新的外周血EGFR基因突變的高靈敏、高特異檢測方法，用于肺癌的早期檢測和診斷，并為肺癌靶向藥物的治療提供依據(jù)。
　　目的：
　　探索一種新的更高靈敏度、更高特異性的 EGFR基因突變檢測方法——數(shù)字PCR法，研究外周血與組織標本EGFR基因突變檢測的一致性，研究外周血EGFR基因突變情況、基因拷貝數(shù)及循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)等應(yīng)用于肺癌早期診斷的可行性及可靠性，為指導NSCLC靶向治療提供依據(jù)。
　　方法：

8、
　　（1）收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院2011年10月~2014年6月共116例病例（80例NSCLC、10例SCLC和26例健康者），整理臨床資料。
　　（2）組織和外周血DNA提取、克隆和EGFR外顯子19、21引物及探針設(shè)計。
　?。?）構(gòu)建基于TaqMan-MGB雙探針熒光定量PCR技術(shù)的EGFR基因突變檢測方法（qPCR），并測試靈敏度、敏感度、重復性及線性相關(guān)性分析。
　?。?）構(gòu)建基于磁力攪拌形成微乳

9、滴技術(shù)的數(shù)字PCR體系模型：探索一種新的油相配方成分，構(gòu)建磁力攪拌形成的油包水微乳滴體系，并實現(xiàn)熒光試劑的PCR擴增（乳液PCR），為下一步構(gòu)建微流控芯片數(shù)字PCR檢測體系提供技術(shù)可行性。
　?。?）構(gòu)建基于微流控形成微液滴技術(shù)的數(shù)字PCR芯片檢測體系：首先進行微流控形成微液滴技術(shù)的可行性實驗，再構(gòu)建基于液滴技術(shù)的微流控芯片數(shù)字PCR檢測體系模型，最后用水痘帶狀皰疹病毒熒光檢測試劑驗證微流控芯片數(shù)字PCR檢測體系的效能。
　

10、?。?）構(gòu)建基于TaqMan-MGB雙探針熒光定量PCR技術(shù)的微流控芯片數(shù)字PCR檢測體系（dPCR），并測試靈敏度、敏感度、重復性及線性相關(guān)性分析。
　?。?）DNA測序法、TaqMan-MGB雙探針熒光定量PCR法（qPCR）及微流控芯片數(shù)字PCR法（dPCR）檢測肺癌及健康者EGFR基因突變情況。
　?。?）分析NSCLC患者EGFR基因突變情況、EGFR基因拷貝數(shù)和突變豐度及外周血循環(huán)DNA濃度等與臨床特征及EGFR

11、-TKIs臨床療效的關(guān)系，
　?。?）免疫組化法測定 NSCLC組織中 EGFR蛋白表達情況，分析 EGFR基因突變與蛋白表達的關(guān)系。
　?。?0）統(tǒng)計學處理：應(yīng)用SPSS19.0軟件，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)或Kruskal-Wallis檢驗，兩組間比較采用卡方檢驗或t檢驗，分析結(jié)果適時取Fisher確切概率法（Fisher’s Exact Test）和McNemar Test結(jié)果，顯著性差異檢驗采用配對

12、資料卡方檢驗，變量間關(guān)系的相關(guān)性分析采用卡方Pearson's R相關(guān)性檢驗判斷，一致性檢驗采用 K檢驗（ Kappa檢驗），生存分析采用Kaplan-Meier法，利用Log-rank檢驗比較組間的PFS差異，各測定值結(jié)果以±s表示。雙側(cè)檢驗水準為α=0.05，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　?。?）成功構(gòu)建了 TaqMan-MGB雙探針熒光定量 PCR檢測體系（qPCR）和一種新穎的微流控芯片數(shù)字PCR

13、檢測體系（dPCR）。
　?。?） qPCR法檢測靈敏度可達101~102copies/μl，檢測突變敏感度可達1%。dPCR法靈敏度在104copies/μl內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，達105copies/μl時陽性乳滴達到飽和，dPCR檢測突變敏感性可達到0.01%~0.001%，即在1萬個野生分子背景中可檢出1個突變分子。dPCR技術(shù)能夠檢測低至0.001%的突變片段，而DNA測序及qPCR法對少于1%的突變是無能為力的，因此d

14、PCR突變檢測靈敏度可提高1000倍。
　?。?）10例SCLC及26例健康者均無EGFR突變，80例NSCLC突變率62.5%（50/80）。dPCR法檢測17例NSCLC癌組織EGFR突變率64.7%（11/17）和配對外周血標本中突變率64.7%（11/17）完全一致。dPCR檢測80例NSCLC外周血標本EGFR突變率62.5%（50/80），EGFR基因突變與性別、年齡、肺癌家族史、吸煙史、病理類型、分化程度、腫瘤分期及

15、有無轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性（P>0.05）；dPCR檢測EGFR突變率Ⅰ期75.0%（6/8）、Ⅱ期70.0%（14/20）、Ⅲ期58.6%（17/29）、Ⅳ期56.5%（13/23），不同分期間檢出率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　?。?）EGFR基因總拷貝數(shù)、突變拷貝數(shù)及突變豐度與患者性別、年齡段、肺癌家族史、吸煙史、腫瘤大小、病理類型、有無遠處轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P>0.05），但突變豐度與腫瘤分期有關(guān)，Ⅰ期突變豐度平均值高于Ⅱ期、Ⅲ

16、期及Ⅳ期（P=0.048），早期（Ⅰ~Ⅱ）突變豐度高于晚期（Ⅲ~Ⅳ）組（P=0.006）。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，EGFR基因含量（總拷貝數(shù)）與ctDNA濃度成線性關(guān)系（R2=0.6196，P<0.0001），而突變拷貝數(shù)與ctDNA量無線性相關(guān)（P>0.05），突變豐度（FAM/HEX）與ctDNA量成負相關(guān)（P<0.05）。
　　（5）80例NSCLC患者分三組：10例突變靶向、40例突變化療和30例野生化療，10例EGFR基因突變患者使

17、用TKI治療后的ORR為50.0%（5/10）和DCR為80.0%（8/10），突變靶向組PFS明顯長于野生化療組和突變化療組（P=0.000），而野生化療組與突變化療組PFS比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.785）。
　?。?）肺癌組織中 EGFR表達的陽性率64.7%(11/17)高于正常肺組織11.8%(2/17)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），EGFR蛋白表達水平與患者性別、年齡、吸煙與否、病理類型、分化程度、TNM分期

18、及是否有遠處轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性（P>0.05），而與原發(fā)腫瘤大小有一定關(guān)系（P<0.05）。NSCLC患者 EGFR蛋白表達與EGFR基因突變無明確相關(guān)性（Pearson's R=0.030，P=0.908>0.05）。
　　結(jié)論：
　　我們建立的TaqMan-MGB雙探針熒光定量PCR法（qPCR）和微流控芯片數(shù)字PCR法（dPCR）靈敏度高、特異性強、檢測結(jié)果準確可靠，尤其dPCR法可用于檢測肺癌組織和外周血循環(huán)DNA標本中

19、的EGFR基因突變，且結(jié)果具有高度的一致性，臨床上可以選擇腫瘤患者外周靜脈血代替癌組織運用dPCR進行基因突變檢測，且早期（Ⅰ期+Ⅱ期）突變率不低于晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）。腫瘤患者外周血游離DNA量明顯增高，尤其當NSCLC發(fā)生外周血行轉(zhuǎn)移時，血液中循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）量和EGFR基因含量增加，而突變豐度值相對降低。因此，檢測外周血EGFR基因突變、循環(huán)腫瘤DNA及突變豐度值等，在腫瘤診斷和早期診斷中具有重要價值，對判斷腫瘤是否進展