肺癌外周血EGFR基因突變高靈敏檢測方法的建立.pdf

1、前言：
　　近年來，我國肺癌的發(fā)病率與死亡率呈明顯上升趨勢，且起病隱匿，早期多無癥狀，約80％患者確診時(shí)已屬晚期，肺癌中達(dá)80%以上病理類型屬于非小細(xì)胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC），包括鱗癌、腺癌、支氣管肺泡細(xì)胞癌、腺鱗癌和大細(xì)胞癌等組織學(xué)類型，放化療后5年生存率仍低于20%。目前，表皮生長因子受體（epidermal growth fator receptor,EGFR）是國內(nèi)外已經(jīng)公

2、認(rèn)的一個(gè)腫瘤靶向治療分子，早在2004年P(guān)aez和Lynch等發(fā)現(xiàn)EGFR突變是對小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor,TKI）敏感的一個(gè)強(qiáng)預(yù)測因子，目前發(fā)現(xiàn)EGFR中exon19（del E746-A750）和exon21（L858R）約占總突變的90%，又叫經(jīng)典突變或熱點(diǎn)突變，兩處熱點(diǎn)突變能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對小分子酪氨酸激酶抑制劑的敏感性。因此，檢測EGFR基因的突變狀態(tài)在NSCLC治療中具有越來

3、越重要的意義。
　　目前癌癥檢測主要依賴于有創(chuàng)性組織病理活檢和細(xì)胞學(xué)檢查，但是臨床上肺癌患者多數(shù)為晚期往往難以取得腫瘤組織標(biāo)本或不易重復(fù)獲取，更難于實(shí)時(shí)監(jiān)測。因此尋找腫瘤組織替代材料（如唾液、糞便、外周血等）用于基因診斷是當(dāng)前迫切需要解決的問題，然而，這些樣品材料具有干擾成分多、肺癌標(biāo)志物含量低等特性，且體細(xì)胞突變多為雜合突變，標(biāo)本中突變基因所占比例通常較少。目前，臨床上常用突變檢測技術(shù)如PCR產(chǎn)物直接測序法、Taqman探針法、

4、突變特異性擴(kuò)增系統(tǒng)(amplificationrefractory mutation system,ARMS)和高分辨率熔解曲線分析法(high resolutionmelting,HRM)等，敏感性都不夠高，大大限制了基因變異檢測在癌癥早期診斷方面的應(yīng)用。為此，需要探索一種新的更高靈敏度、更高特異性的EGFR基因突變檢測方法。
　　本論文是基于“973”課題（項(xiàng)目編號(hào)：2012CB933300）“基于納米技術(shù)的肺癌早期檢測研究”

5、和國家自然科學(xué)基金課題（項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)61271162）“高靈敏檢測肺癌外周血中EGFR基因突變的數(shù)字PCR芯片”的項(xiàng)目支持。博士課題階段，我們構(gòu)建了TaqMan-MGB雙探針熒光定量PCR檢測體系（TaqMan-MGB Dual-probe Real-time PCR/ TaqMan-MGB Dual Probes Fluorescence Real-time Quantitative PCR）和微流控芯片數(shù)字PCR檢測體系（Microf

6、luidic Chip Digital PCR）等，為便于以下敘述，分別簡記為qPCR和dPCR。鑒于外周血中腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的循環(huán)DNA量比較少、突變DNA分子更少的特點(diǎn)，通過制作含有納升級乳滴微反應(yīng)器的數(shù)字PCR芯片，將待測DNA分子分散到上萬個(gè)納升級的乳滴中，結(jié)合位點(diǎn)特異性擴(kuò)增及TaqMan熒光探針，通過檢測每一乳滴的信號(hào)獲得EGFR突變情況，利用建立的EGFR基因突變檢測方法，研究外周血與組織標(biāo)本EGFR基因突變的一致性，在此基礎(chǔ)上

7、探索一種新的外周血EGFR基因突變的高靈敏、高特異檢測方法，用于肺癌的早期檢測和診斷，并為肺癌靶向藥物的治療提供依據(jù)。
　　目的：
　　探索一種新的更高靈敏度、更高特異性的 EGFR基因突變檢測方法——數(shù)字PCR法，研究外周血與組織標(biāo)本EGFR基因突變檢測的一致性，研究外周血EGFR基因突變情況、基因拷貝數(shù)及循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)等應(yīng)用于肺癌早期診斷的可行性及可靠性，為指導(dǎo)NSCLC靶向治療提供依據(jù)。
　　方法：

8、
　?。?）收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011年10月~2014年6月共116例病例（80例NSCLC、10例SCLC和26例健康者），整理臨床資料。
　?。?）組織和外周血DNA提取、克隆和EGFR外顯子19、21引物及探針設(shè)計(jì)。
　　（3）構(gòu)建基于TaqMan-MGB雙探針熒光定量PCR技術(shù)的EGFR基因突變檢測方法（qPCR），并測試靈敏度、敏感度、重復(fù)性及線性相關(guān)性分析。
　?。?）構(gòu)建基于磁力攪拌形成微乳

9、滴技術(shù)的數(shù)字PCR體系模型：探索一種新的油相配方成分，構(gòu)建磁力攪拌形成的油包水微乳滴體系，并實(shí)現(xiàn)熒光試劑的PCR擴(kuò)增（乳液PCR），為下一步構(gòu)建微流控芯片數(shù)字PCR檢測體系提供技術(shù)可行性。
　?。?）構(gòu)建基于微流控形成微液滴技術(shù)的數(shù)字PCR芯片檢測體系：首先進(jìn)行微流控形成微液滴技術(shù)的可行性實(shí)驗(yàn)，再構(gòu)建基于液滴技術(shù)的微流控芯片數(shù)字PCR檢測體系模型，最后用水痘帶狀皰疹病毒熒光檢測試劑驗(yàn)證微流控芯片數(shù)字PCR檢測體系的效能。
　

10、　（6）構(gòu)建基于TaqMan-MGB雙探針熒光定量PCR技術(shù)的微流控芯片數(shù)字PCR檢測體系（dPCR），并測試靈敏度、敏感度、重復(fù)性及線性相關(guān)性分析。
　?。?）DNA測序法、TaqMan-MGB雙探針熒光定量PCR法（qPCR）及微流控芯片數(shù)字PCR法（dPCR）檢測肺癌及健康者EGFR基因突變情況。
　?。?）分析NSCLC患者EGFR基因突變情況、EGFR基因拷貝數(shù)和突變豐度及外周血循環(huán)DNA濃度等與臨床特征及EGFR

11、-TKIs臨床療效的關(guān)系，
　　（9）免疫組化法測定 NSCLC組織中 EGFR蛋白表達(dá)情況，分析 EGFR基因突變與蛋白表達(dá)的關(guān)系。
　?。?0）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS19.0軟件，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)，分析結(jié)果適時(shí)取Fisher確切概率法（Fisher’s Exact Test）和McNemar Test結(jié)果，顯著性差異檢驗(yàn)采用配對

12、資料卡方檢驗(yàn)，變量間關(guān)系的相關(guān)性分析采用卡方Pearson's R相關(guān)性檢驗(yàn)判斷，一致性檢驗(yàn)采用 K檢驗(yàn)（ Kappa檢驗(yàn)），生存分析采用Kaplan-Meier法，利用Log-rank檢驗(yàn)比較組間的PFS差異，各測定值結(jié)果以±s表示。雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　?。?）成功構(gòu)建了 TaqMan-MGB雙探針熒光定量 PCR檢測體系（qPCR）和一種新穎的微流控芯片數(shù)字PCR

13、檢測體系（dPCR）。
　?。?） qPCR法檢測靈敏度可達(dá)101~102copies/μl，檢測突變敏感度可達(dá)1%。dPCR法靈敏度在104copies/μl內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，達(dá)105copies/μl時(shí)陽性乳滴達(dá)到飽和，dPCR檢測突變敏感性可達(dá)到0.01%~0.001%，即在1萬個(gè)野生分子背景中可檢出1個(gè)突變分子。dPCR技術(shù)能夠檢測低至0.001%的突變片段，而DNA測序及qPCR法對少于1%的突變是無能為力的，因此d

14、PCR突變檢測靈敏度可提高1000倍。
　?。?）10例SCLC及26例健康者均無EGFR突變，80例NSCLC突變率62.5%（50/80）。dPCR法檢測17例NSCLC癌組織EGFR突變率64.7%（11/17）和配對外周血標(biāo)本中突變率64.7%（11/17）完全一致。dPCR檢測80例NSCLC外周血標(biāo)本EGFR突變率62.5%（50/80），EGFR基因突變與性別、年齡、肺癌家族史、吸煙史、病理類型、分化程度、腫瘤分期及

15、有無轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性（P>0.05）；dPCR檢測EGFR突變率Ⅰ期75.0%（6/8）、Ⅱ期70.0%（14/20）、Ⅲ期58.6%（17/29）、Ⅳ期56.5%（13/23），不同分期間檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　（4）EGFR基因總拷貝數(shù)、突變拷貝數(shù)及突變豐度與患者性別、年齡段、肺癌家族史、吸煙史、腫瘤大小、病理類型、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P>0.05），但突變豐度與腫瘤分期有關(guān)，Ⅰ期突變豐度平均值高于Ⅱ期、Ⅲ

16、期及Ⅳ期（P=0.048），早期（Ⅰ~Ⅱ）突變豐度高于晚期（Ⅲ~Ⅳ）組（P=0.006）。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，EGFR基因含量（總拷貝數(shù)）與ctDNA濃度成線性關(guān)系（R2=0.6196，P<0.0001），而突變拷貝數(shù)與ctDNA量無線性相關(guān)（P>0.05），突變豐度（FAM/HEX）與ctDNA量成負(fù)相關(guān)（P<0.05）。
　?。?）80例NSCLC患者分三組：10例突變靶向、40例突變化療和30例野生化療，10例EGFR基因突變患者使

17、用TKI治療后的ORR為50.0%（5/10）和DCR為80.0%（8/10），突變靶向組PFS明顯長于野生化療組和突變化療組（P=0.000），而野生化療組與突變化療組PFS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.785）。
　?。?）肺癌組織中 EGFR表達(dá)的陽性率64.7%(11/17)高于正常肺組織11.8%(2/17)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），EGFR蛋白表達(dá)水平與患者性別、年齡、吸煙與否、病理類型、分化程度、TNM分期

18、及是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性（P>0.05），而與原發(fā)腫瘤大小有一定關(guān)系（P<0.05）。NSCLC患者 EGFR蛋白表達(dá)與EGFR基因突變無明確相關(guān)性（Pearson's R=0.030，P=0.908>0.05）。
　　結(jié)論：
　　我們建立的TaqMan-MGB雙探針熒光定量PCR法（qPCR）和微流控芯片數(shù)字PCR法（dPCR）靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，尤其dPCR法可用于檢測肺癌組織和外周血循環(huán)DNA標(biāo)本中

19、的EGFR基因突變，且結(jié)果具有高度的一致性，臨床上可以選擇腫瘤患者外周靜脈血代替癌組織運(yùn)用dPCR進(jìn)行基因突變檢測，且早期（Ⅰ期+Ⅱ期）突變率不低于晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）。腫瘤患者外周血游離DNA量明顯增高，尤其當(dāng)NSCLC發(fā)生外周血行轉(zhuǎn)移時(shí)，血液中循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）量和EGFR基因含量增加，而突變豐度值相對降低。因此，檢測外周血EGFR基因突變、循環(huán)腫瘤DNA及突變豐度值等，在腫瘤診斷和早期診斷中具有重要價(jià)值，對判斷腫瘤是否進(jìn)展