2014年09月18日細胞培養(yǎng)平臺課

1、細 胞 與 組 織 培 養(yǎng) 技 術,李 呼 倫哈爾濱醫(yī)科大學神經(jīng)生物學教研室 2014.09.18,前 言,,組織培養(yǎng)技術的應用,基礎研究工業(yè)化生產(chǎn),Park IH, et al. Cell. 2008 Sep 5;134(5):877-86.,病毒組織培養(yǎng)疫苗生產(chǎn),,基因工程產(chǎn)品,層析 和 超濾,分離、濃縮生物大分子 常用的手段,試管嬰兒,,,,,,,靜止培養(yǎng),旋轉培養(yǎng),振

2、蕩培養(yǎng),生物反應器高密度培養(yǎng),,厭氧培養(yǎng),一、細胞培養(yǎng)方式,二、體 外 培 養(yǎng) 的 分 類,體外培養(yǎng) in vitro細胞培養(yǎng) Cell culture 組織培養(yǎng) Tissue culture 器官培養(yǎng) Organ culture,體外培養(yǎng)種類,細胞培養(yǎng) （ Cell culture ）,培養(yǎng)物是單細胞或群體細胞 模擬體內生理環(huán)境，在無菌、適當?shù)臏囟群鸵欢ǖ臓I養(yǎng)條件下，使之生長生存維持結構和功能的培養(yǎng)方法。,組織培養(yǎng)

3、（Tissue culture）,方法同上，使用組織塊(0.5-1mm3)或薄片(0.2mm),器官培養(yǎng)（Organ culture）,應用和組織培養(yǎng)相似的條件，培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法使用器官原基或器官的一部分或整個器宮,三、組織與細胞培養(yǎng)的優(yōu)缺點,優(yōu)點：能長時間直接觀察活細胞的形態(tài)結構和生命活動；可用于細胞學、遺傳學、免疫學、實驗醫(yī)學和腫瘤學等多種學科的研究工作便

4、于觀察、記錄、攝影，直接觀察細胞變化 可供研究的細胞種類廣泛，從低等生物到高等動物，以及人類；從胚胎到成體；從正常組織到腫瘤細胞皆可 便于使用不同方法研究細胞（相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、組織化學和同位素標記等）,,培養(yǎng)細胞攜帶有與體內細胞同等的基因組，是分子生物學和基因工程學的研究對象和組成部分可同時提供大量生物性狀相似的實驗對象，耗資少，經(jīng)濟易于施加物理、化學和生物因素進行實驗 已成為生物制品、基因工程制品、單克隆

5、抗體生產(chǎn)的必要手段,局限性： 組織和細胞離體以后，獨立生存在人工培養(yǎng)環(huán)境中，與體內環(huán)境相比，仍有很大差異。故實驗結果不能推至體內，輕易做出與體內等同的結論,,四、組織與細胞培養(yǎng)的細胞生物學特點,體內外細胞的差異：當人工條件和體內實際情況不完全相同時，細胞在體外培養(yǎng)后，一旦失去神經(jīng)體液調節(jié)和細胞間相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，發(fā)生變化則是必然。細胞最多見的表現(xiàn)是：返祖（Atavism）現(xiàn)象，即失去原有組織結構和細胞形態(tài)、

6、分化減弱、細胞趨單一化、不死性、惡性狀態(tài)。細胞增殖和分化：是細胞生命進化中所獲得的基本屬性，增殖使細胞數(shù)量增多；分化使機體結構和功能多樣化，最后演變成完整的有機體。,五、培養(yǎng)細胞的狀態(tài),貼附型能貼附在支持物表面生長。大多數(shù)培養(yǎng)細胞呈貼附性生長；只依賴于貼附才能生長貼附后，易失去其原有的特征，細胞分化現(xiàn)象常不顯著。在形態(tài)上表現(xiàn)單一化的現(xiàn)象，并常反應其胚層起源，呈現(xiàn)類似“返祖現(xiàn)象”成纖維型細胞、上皮型細胞、游走型細胞及多形型細胞

7、 懸浮型,,成纖維型細胞細胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質突起，生長時呈放射狀 成纖維細胞 、心肌、平滑肌、成骨細胞、骨髓基質干細胞等,,上皮型細胞扁平不規(guī)則多角形，中有圓形核，細胞緊密相連成單層膜消化管外皮細胞、肝、胰、肺泡上皮、血管內皮等,,游走型細胞在支持物上散在生長，一般不連接成片。細胞質經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，速度快而且不規(guī)則神經(jīng)膠質細胞,,多形型細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的

8、形態(tài) 神經(jīng)組織細胞,,懸浮型見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞和血液細胞胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長容易大量繁殖,六、培養(yǎng)細胞生長的條件,營養(yǎng)生存環(huán)境溫度: 37 ℃O2CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.0-7.2 滲透壓無污染無毒,組織培養(yǎng)室的設施及條件,壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒。用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時）。主要用干玻

9、璃器皿消毒 濾器：過濾除菌。大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌 超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈 ：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒,七、無 菌 操 作,,,無菌室的滅菌定期打掃無菌室實驗前滅菌實驗后滅菌實驗人員的無菌準備肥皂洗手穿隔離衣酒精棉球擦手,無菌操作中常犯的錯誤,吸管、剪刀等碰到其他器皿,無菌操作中常犯的錯誤,正確的拿管姿勢,錯誤的拿管

10、姿勢,拿吸管時手碰到無菌區(qū),無菌操作中常犯的錯誤,培養(yǎng)基浸濕吸管底部的棉花,八、細 胞 和 組 織 培 養(yǎng),將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。1、組織塊培養(yǎng) 直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。2、細胞培養(yǎng) 一般應在接入培養(yǎng)器皿之前進行細胞計數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細胞進入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細胞盡早進入生長狀態(tài)。

11、,計 數(shù) 細 胞,細胞數(shù)/ml=計數(shù)16格×稀釋倍數(shù) ×104,,,,,細胞數(shù)/ml=計數(shù)16格個數(shù)/個數(shù)×稀釋倍數(shù)×104,培養(yǎng)細胞的觀察,每隔一定時間觀察一次是否生長良好形態(tài)是否正常有無污染培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示）定時檢查培養(yǎng)溫度和CO2濃度,概 念,原代培養(yǎng) 直接從體內取出的細胞、組織和器官進行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進行傳代培養(yǎng)（Sub

12、culture）的細胞，便不再稱為原代培養(yǎng)，而改稱為細胞系。 傳代培養(yǎng) 細胞長滿瓶底后要進行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。,取 材,理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容

13、易培養(yǎng)。,細 胞 培 養(yǎng) 的 準 備 工 作,,九、原 代 培 養(yǎng),,組 織 塊 法,新鮮取材的組織中 細胞仍具有分裂增殖的能力。將組織切成小塊培養(yǎng)在模擬體內的環(huán)境中，小塊組織的細胞可以游離出來，從培養(yǎng)液中吸取營養(yǎng)，繼續(xù)分裂生長。 組織塊培養(yǎng)法適用范圍廣，常用于肝臟、皮膚、角膜、骨骼、韌帶、血管、神經(jīng)、心臟等器官和組織的培養(yǎng)。,培 養(yǎng) 要 點,材料新鮮嚴格無菌操作剔除脂肪等附著組織組織塊剪?。ㄖ睆僵?mm）擺放

14、開（間距﹥5mm）,常 犯 的 錯 誤,操作中不換器械沖洗次數(shù)不夠組織碎片太大組織塊擺放太密培養(yǎng)液加入太多,消 化 培 養(yǎng) 法,消化培養(yǎng)法所用的酶有多種，目前應用最廣的是胰蛋白酶。它是一種內切酶，可專一水解有精胺酸或賴氨酸的羧基形成的肽鍵。從而消除妨礙細胞生長的細胞間質，包括基質、纖維等，使細胞分散，易于貼壁并從外界吸收養(yǎng)分和排除代謝物 。消化法適用于組織量大的原代培養(yǎng)。胰蛋白酶液適用于消化間質少的組織，如羊膜、胚胎、上皮、肝

15、和腎等組織及傳代細胞。,培 養(yǎng) 要 點,組織剪碎至1mm3左右合適的胰蛋白酶濃度（通常為0.25%）合適的消化時間：消化時，待組織塊變得較疏松，顏色略白為止（通常為37℃，20～40分鐘）,常 犯 的 錯 誤,水浴鍋未預熱,組織塊太大,胰蛋白酶消化不足或過度,吹打用力過重,常 犯 的 錯 誤,十、傳 代 細 胞 培 養(yǎng),細胞在原培養(yǎng)瓶內分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的操作叫傳代。為獲得穩(wěn)定的細胞株，或大量的同種細胞，當培養(yǎng)細胞形成致密的單

16、層后需進行傳代培養(yǎng)。,細 胞 傳 代 方 法,根據(jù)細胞生長的特點，傳代方法有3種懸浮生長細胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代 直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l/2～2/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代半懸浮生長細胞傳代 此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代貼壁生長細胞傳代 采用酶

17、消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液,貼壁生長細胞傳代方法,吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液PBS洗一次加入1～2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準）靜置2～10 min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液用吸管吸取瓶內培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液吸取1/10～1/40細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),Trypsin

18、消化細胞,未消化細胞,消化的細胞,培 養(yǎng) 要 點,嚴格的無菌操作適度消化,細胞培養(yǎng)中需要注意的問題,培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細胞生長，不能盲目增加每單位體積的細胞濃度PH：初培養(yǎng)pH應為7.4，培養(yǎng)過程應不低于7.0培養(yǎng)瓶內的空間：一般培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10,細胞培養(yǎng)中需要注意的問題,容積、深度、表面面積：培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.2～0.5ml/cm2。需高濃度氧的

19、，在淺的培養(yǎng)液（2mm）中生長較好；需要低濃度氧的,在深的培養(yǎng)液（5mm）中生長較好。去除死細胞溫度控制：動物細胞培養(yǎng)對溫度波動的敏感性很大。溫度低于36.5℃，細胞生長緩慢；溫度高于37.5℃，細胞存活力降低,十一、細 胞 凍 存 和 復 蘇,,細胞凍存的意義,細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費，減少污染，減少細胞生物學特性變化,凍存細胞的理論基礎,當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化

20、：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶,凍存和復蘇的原則,慢 凍 快 融,細 胞 凍 存 方 法,預先配制凍存液： 90%血清 10%DMSO （二甲基亞砜）取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，

21、加入適量凍存液，用吸管吹打制成細胞懸液（1×106～5×106細胞/ml)加入1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期,慢 凍 程 序,標準程序當溫度在-25 ℃以上時，1～2 ℃/min當溫度達-25 ℃以下時，5～10℃/min當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中簡易程序 將凍存管于4℃放置1小時，于-20℃放置1小時， -80℃放置1小時/通過線繩將裝有冷凍管的紗布袋固定于

22、液氮罐罐口（-70℃），放置1小時，后直接投入液氮中（-196℃）,細 胞 復 蘇 方 法,從液氮中取出凍存管，在37～38℃水浴中快速使其融化（1分鐘左右）5分鐘內用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上低速離心10分鐘去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞,十二、 ATCC入庫細胞要求,培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細胞已傳代數(shù)等 凍 存 液：培養(yǎng)基和防凍液名稱細胞活力：融解前后

23、細胞接種存活率和生長特性培 養(yǎng) 液：培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、血清來源和含量細胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細胞等，融解后細胞生長特性核 型：二倍體或多倍體，標記染色體的有無無污染檢測：包括細菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等物種檢測：檢測同工酶，主要為G6PD和LDH，以證明細胞有否交叉污染以及反轉錄酶檢測免疫檢測：一兩種血清學檢測細胞建立者：建立者姓名；檢測者姓名,中國典型培養(yǎng)物保藏中心,中國典型培養(yǎng)物