龍山泉啤酒生物穩(wěn)定性與無菌釀造

1、啤酒生物穩(wěn)定性與無菌釀造,啤酒生物穩(wěn)定性與無菌釀造,1、啤酒純粹發(fā)酵2、成品啤酒的生物穩(wěn)定性3、為什么要發(fā)展“純生”瓶罐裝啤酒4、啤酒釀造中污染微生物的種類和對啤酒的危害5、啤酒污染微生物來源的防治6、啤酒污染菌傳統(tǒng)檢測鑒定技術(shù)7、啤酒污染菌的快速檢測鑒定技術(shù),啤酒純粹發(fā)酵,自六十年代以來人們推出新一代瓶裝罐裝“純生”啤酒。啤酒開始擺脫了傳統(tǒng)觀念。 像做抗生素一樣，在整個(gè)釀造和包裝過程中，力求擺脫一切細(xì)菌污染。僅僅只

2、有純培養(yǎng)啤酒酵母的發(fā)酵。 不能認(rèn)為純生啤酒，僅僅是通過現(xiàn)代無菌過濾加無菌包裝手段制得的。純生啤酒是建立在整個(gè)釀造、過濾、包裝全過程對污染微生物的嚴(yán)格控制基礎(chǔ)上。 它是建立在像制藥工業(yè)一樣的先進(jìn)裝備、科學(xué)衛(wèi)生管理、嚴(yán)密檢測基礎(chǔ)上，是啤酒釀造技術(shù)劃時(shí)代進(jìn)步。,啤酒的純粹發(fā)酵,創(chuàng)造“無菌”條件是確保酵母純種發(fā)酵，啤酒口味純正的必要前提和重要基礎(chǔ)。如果制作純生啤酒，更需要確保酵母純種發(fā)酵，其它別無選擇。整個(gè)啤酒釀造過程，除培養(yǎng)

3、酵母外，還存在著形形色色、各種各樣的污染微生物，包括細(xì)菌、酵母菌、霉菌等。,成品啤酒的生物穩(wěn)定性,–非常低的氧含量環(huán)境（<0.1ppm）–低pH值（約3.8-4.7，低于多數(shù)細(xì)菌可以生長的極限）–酒花苦味物質(zhì)（異-α酸17-55ppm）–一定濃度酒精（0.5%-5%w/w）–特定營養(yǎng)和生長基質(zhì)的缺乏–啤酒發(fā)酵溫度較低,成品啤酒的生物穩(wěn)定性,由于酵母的發(fā)酵，易被利用的碳源和氮源（如單糖、氨基酸）幾乎消耗殆盡。氧的缺乏和低

4、pH值創(chuàng)造了啤酒抗腐敗的良好環(huán)境，并且抑制了致病菌的生長。酒花苦味物質(zhì)和酒精對細(xì)菌強(qiáng)的抑制效果也是重要因素。 啤酒具有一定的抗腐敗性。,成品啤酒的生物穩(wěn)定性,啤酒并非絕對安全的，仍然包含了一定的糖、氨基酸、無機(jī)物和其他一些微量營養(yǎng)物質(zhì)，其中包括由酵母中間代謝或酵母自溶產(chǎn)生的各種特殊物質(zhì)，而這些物質(zhì)對啤酒有害菌而言提供了是最基本的營養(yǎng)需求。,成品啤酒的生物穩(wěn)定性,仍有少數(shù)細(xì)菌可以在這種惡劣的環(huán)境下生長，導(dǎo)致啤酒

5、腐敗。這些細(xì)菌既有革蘭氏陽性也有陰性菌。革蘭氏陽性菌幾乎都是乳酸菌，在啤酒廠特別有害，導(dǎo)致最嚴(yán)重的細(xì)菌腐敗事故。引起啤酒腐敗的革蘭氏陰性細(xì)菌數(shù)量不多。其中醋酸菌屬曾引起人們的極大注意。野生酵母的污染也是需要我們關(guān)注的。,成品啤酒的生物穩(wěn)定性,由于微生物的污染，造成啤酒穩(wěn)定性的破壞保證成品啤酒的生物穩(wěn)定性的措施 ——啤酒釀造過程的微生物管理 ——清酒的過濾 ——啤酒的巴氏消毒 ——啤酒中微生物含量

6、在一定范圍以內(nèi) ——啤酒中營養(yǎng)物質(zhì)含量在限度以內(nèi)目前國內(nèi)熟啤酒的生物穩(wěn)定性較有保障,啤酒生物穩(wěn)定性與無菌釀造,1、啤酒純粹發(fā)酵2、成品啤酒的生物穩(wěn)定性3、為什么要發(fā)展“純生”瓶罐裝啤酒4、啤酒釀造中污染微生物的種類和對啤酒的危害5、啤酒污染微生物來源的防治6、啤酒污染菌傳統(tǒng)檢測鑒定技術(shù)7、啤酒污染菌的快速檢測鑒定技術(shù),巴氏殺菌的熟啤酒,自從巴斯德發(fā)明和采用低熱消毒能保存酒類等食品，瓶裝啤酒或其它發(fā)酵酒就一直沿用此法

7、。裝瓶后酒類在60℃—65℃，經(jīng)過15—30分鐘的低熱消毒，可以把啤酒中酵母、野生酵母和引起啤酒污染變質(zhì)的細(xì)菌大部分殺死，控制在不足以危害啤酒的水平。這就是我們稱謂的熟啤酒。,瞬時(shí)殺菌啤酒,60年代以后，采用70℃—75℃，瞬時(shí)加熱啤酒（20—40秒）再冷卻至4℃以下。再通過包裝物的無菌化處理，在無菌條件下灌裝，也可以得到另一類熟啤酒（歐洲較為流行）。,啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性,60年代以后，啤酒風(fēng)格崇尚淡爽化、新鮮的口感。人們發(fā)現(xiàn)啤酒在有

8、氧條件下進(jìn)行熱處理對新鮮口感造成損害時(shí)不可彌補(bǔ)的。人們開始努力控制啤酒中氧的含量?，F(xiàn)在已能控制在100ppb—400ppb以下。但還是對啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性造成嚴(yán)重的損害。啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性大約為1—4個(gè)月，低熱或瞬時(shí)消毒就成為啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性的最大障礙?，F(xiàn)在日本85%，美國30%啤酒均不經(jīng)過熱消毒而獲得生物穩(wěn)定性與熟啤酒一樣的純生啤酒。我們的啤酒專家十年前就呼吁研制純生啤酒，1998年珠江第一家生產(chǎn)出了純生啤酒。現(xiàn)在有實(shí)力和有遠(yuǎn)見的企業(yè)

9、都在紛紛上馬純生啤酒的項(xiàng)目，為自己的產(chǎn)品升級換代而努力工作著。這也是行業(yè)內(nèi)的一大可喜飛躍。,啤酒釀造污染微生物的種類和對啤酒的危害,由于麥汁和發(fā)酵液為酸性（Ph5.4—4.0），啤酒發(fā)酵為厭氧條件和酒花中的α—酸對一些革蘭氏陽性菌有抑制作用，霉菌、放線菌很難在啤酒中生長和繁殖。危害啤酒質(zhì)量的是那些能在麥汁和啤酒中生長和繁殖的微生物，主要是各種野生酵母和某些屬的細(xì)菌。,微生物分類,好氧微生物微好氧微生物兼性厭氧微生物絕對厭氧微生物,

10、啤酒污染菌的特點(diǎn),耐酸耐酒花耐酒精,啤酒污染微生物污染時(shí)期特點(diǎn),麥汁和發(fā)酵前期污染好氧微生物，兼性好氧微生物。發(fā)酵中后期的啤酒中污染微生物常常是以微好氧和兼性好氧微生物為主。當(dāng)發(fā)酵后期溶氧含量達(dá)到10—20ppb時(shí)，發(fā)現(xiàn)污染的啤酒是絕對厭氧細(xì)菌。,啤酒污染微生物的危害,啤酒總酸升高高級醇升高雙乙酰升高或反彈啤酒口味不協(xié)調(diào)，有雜異味啤酒粘度增加，混濁無菌濾膜堵塞影響酵母正常生長與發(fā)酵潛在的危險(xiǎn)源,啤酒污染微生物的種類

11、及特性,腸桿菌群（革蘭氏陰性菌）乳酸桿菌屬（革蘭氏陽性菌） （片球菌：也叫四聯(lián)球菌，八疊球菌）醋酸菌群發(fā)酵單孢菌（革蘭氏陰性菌）芽孢桿菌野生酵母,啤酒污染微生物的種類及特性,腸桿菌群—這是一群能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的無芽孢桿菌，好氧或兼性厭氧生長。在麥汁和發(fā)酵前期生長繁殖。不同腸桿菌的代謝產(chǎn)物有各種不同的怪味。有酚味、藥味、硫化氫味、二甲基硫等。腸桿菌的污染將會(huì)極大地影響啤酒的口味和香氣。如一種腸桿菌若在發(fā)酵前期繁殖至10

12、4/ml，它們能分泌雙乙酰（0.14mg/L），DMS120ug/l，造成釀造啤酒變味。,啤酒污染微生物的種類及特性,乳酸桿菌屬—是啤酒發(fā)酵中污染最多的微生物。它大多數(shù)是微好氧菌。在微量氧和大量CO2條件下生長度好。乳酸桿菌屬一般需要復(fù)雜的培養(yǎng)基。當(dāng)啤酒酵母死亡，自溶分泌了大量乳酸菌生長必須的維生素，短肽，乳酸桿菌就有機(jī)會(huì)大量繁殖。所以啤酒發(fā)酵后期可檢測它最高濃度。我們在啤酒廠檢測后酵液，?？蓹z測到103—105個(gè)/ml，它們也

13、是雙乙酰反彈的主要元兇。當(dāng)污染率達(dá)103個(gè)/ml時(shí)已使雙乙酰反彈。污染乳酸桿菌大多是異型發(fā)酵乳酸菌，產(chǎn)生醋酸和乳酸，輕度污染>103個(gè)/ml能使啤酒揮發(fā)酸超標(biāo)（>70mg/L）。重度污染>105個(gè)/ml時(shí)，乳酸量可達(dá)200—300mg/kg，啤酒后期滴定酸度>2.0ml 1molNaOH/100ml啤酒。,啤酒污染微生物的種類及特性,啤酒片球菌屬（有害片球菌）—生長最適溫度是25℃←32℃，能引起酒液混濁，

14、失光、產(chǎn)酸、產(chǎn)生粘質(zhì)。啤酒可拉絲，還產(chǎn)生黃油味的雙乙酰，有討厭的氣味，無法下咽。,啤酒污染微生物的種類及特性,醋酸菌群—醋酸菌好氧生長。常在麥芽汁及發(fā)酵的前期發(fā)現(xiàn)。常在酵母泥中發(fā)現(xiàn)醋酸菌的存在。,啤酒污染微生物的種類及特性,發(fā)酵單孢菌—嫌氣性桿菌。在厭氧條件下快速發(fā)酵葡萄糖生成乙醇和CO2,嚴(yán)重影響啤酒口味，產(chǎn)生絲光混濁。代謝產(chǎn)生較多的乙醛和硫化氫,啤酒污染微生物的種類及特性,啤酒巨球菌在15—37℃、最適28℃，Ph4.1以上生長。

15、酒精濃度2.8（w/v）以上時(shí)生長受到抑制，但忍耐極限5.5（w/v）。嚴(yán)格厭氧菌。該菌引起的啤酒腐敗和梳狀菌相似：產(chǎn)生混濁，生成一定數(shù)量的丁酸，和數(shù)量較少的乙酸、異戊酸、戊酸、己酸及乙偶姻。和梳狀菌一樣產(chǎn)生的硫化氫，啤酒放出臭味。因此也是啤酒廠最令人討厭的細(xì)菌之一。,啤酒污染微生物的種類及特性,芽孢桿菌—可在53℃或糖化醪中生長，甚至有的能在60℃—70℃生長，并產(chǎn)生較多的乳酸，使麥汁酸敗。常在過濾槽篩板下污垢中生長。,啤酒污染微生

16、物的種類及特性,野生酵母—野生酵母污染常見于敞口傳統(tǒng)發(fā)酵池。特別是春秋天，發(fā)酵極易污染漢遜酵母、檸檬克拉克酵母。由于野生酵母外形及代謝產(chǎn)物后發(fā)酵時(shí)經(jīng)常是魏氏酵母污染，形成超發(fā)酵度（麥汁發(fā)酵度高于麥汁極限發(fā)酵度）。啤酒,啤酒微生物的來源和防治,啤酒廠污染微生物的來源,在啤酒釀造的整個(gè)過程非常復(fù)雜，釀造周期長達(dá)20多天，包括原料粉碎處理、糖化，麥汁澄清、冷卻、充氧，接種發(fā)酵，過濾，成品包裝等一系列過程。整個(gè)釀造是由大量的啤酒生產(chǎn)原料及裝備

17、完成的，每個(gè)環(huán)節(jié)都有可能遭到啤酒有害菌的侵入，要完全杜絕雜菌污染幾乎完全不可能。因此，管理先進(jìn)的啤酒生產(chǎn)企業(yè)非常注重對釀造過程每個(gè)環(huán)節(jié)的微生物檢測監(jiān)控。以下羅列的是啤酒廠污染微生物的主要來：,啤酒廠污染微生物的來源,生產(chǎn)環(huán)境：生產(chǎn)車間機(jī)廠區(qū)周圍環(huán)節(jié)衛(wèi)生，包括：空間、地面、墻壁、設(shè)備表面、下水道等。生產(chǎn)用水：主要是指投料水、啤酒稀釋用水等啤酒釀造用水、設(shè)備清洗水，水中含菌量高，可直接污染發(fā)酵液、清酒、設(shè)備等。壓縮空氣、CO2、N2

18、：壓縮空氣通過麥汁充氧污染麥汁和酵母擴(kuò)培液；回收CO2和制備N2在發(fā)酵罐、酵母罐、緩沖罐和清酒罐備壓時(shí)污染酵母及酒業(yè)，也會(huì)在灌裝時(shí)污染成品啤酒,啤酒廠污染微生物的來源,種酵母：酵母在擴(kuò)大培養(yǎng)、回收和使用過程因無菌操作不嚴(yán)格造成酵母污染，目前，酵母泥污染已經(jīng)成為啤酒釀造中污染菌的主要來源。設(shè)備、管道容器等：包括物料輸送管道、閥門、發(fā)酵罐、過濾機(jī)、清酒罐、儲(chǔ)酒罐、灌裝機(jī)等，因清洗殺菌不徹底造成釀造過程各個(gè)環(huán)節(jié)的污染。各種添加劑與啤酒過濾

19、介質(zhì)：添加劑本身含菌及添加過程及過濾介質(zhì)使用不當(dāng)，都會(huì)污染酒液。操作人員及其操作不當(dāng)造成污染。,啤酒廠污染微生物的來源,在上述污染微生物的來源中，種酵母、酵母泥、壓縮空氣、釀造用水、發(fā)酵設(shè)備及管路是造成啤酒污染的主要因素。因此，啤酒廠建立一套完整、系統(tǒng)的微生物管理體系，從而對以上目標(biāo)進(jìn)行嚴(yán)格的微生物監(jiān)測和監(jiān)控是減少啤酒污染的最有效途徑。,我國部分啤酒廠微生物管理現(xiàn)狀,沒有建立主要污染菌（好氧菌、厭氧菌）檢測方法。啤酒酵母擴(kuò)培工藝不

20、合理有待改進(jìn)，需要建立和加強(qiáng)啤酒酵母回收管理工作。酵母管理專業(yè)人員需要提高理論知識水平，提高業(yè)務(wù)能力。缺乏一套嚴(yán)格、有效地衛(wèi)生管理制度，特別要加強(qiáng)釀造車間、灌裝車間的衛(wèi)生管理。,我國部分啤酒廠微生物管理現(xiàn)狀,缺乏一套污染微生物的監(jiān)控監(jiān)測體系，企業(yè)上下對污染菌可能造成的嚴(yán)重后果缺乏認(rèn)識。部分工廠設(shè)備比較落后，CIP清洗不到位。車間衛(wèi)生狀況有待改進(jìn)。,啤酒污染微生物的預(yù)防措施,建立和完善污染菌（好氧菌、厭氧菌、野生酵母等）檢測方法。

21、建立污染微生物的監(jiān)控監(jiān)測體系。需要建立和加強(qiáng)啤酒酵母的科學(xué)管理。酵母管理專業(yè)人員需要提高理論知識水平，提高業(yè)務(wù)能力。建立一套嚴(yán)格、有效地衛(wèi)生管理制度，特別要加強(qiáng)釀造車間、灌裝車間的衛(wèi)生管理。建立合理有效地設(shè)備管路CIP清洗制度,啤酒污染微生物的治理,空氣空氣是啤酒污染微生物的第一源頭。麥汁充氧用空氣，管道、大罐中存在空氣，好多廠背壓頂酒用空氣?？諝庵形⑸锎蠖嘁栏皆诳諝庵形⒘＃ㄈ鐗m埃）上，不凈空氣中可以達(dá)到103—104個(gè)

22、/L，過去啤酒廠要求建立在潔凈地區(qū)。傳統(tǒng)啤酒廠常用30cm厚棉花、活性炭過濾。終端再用10cm厚棉花過濾。由于空氣中有大量水份，（11—30mg/L空氣）過濾介質(zhì)棉花和活性炭易吸水，造成失去過濾性能，甚至成污染源和細(xì)菌庫。,啤酒污染微生物的治理,現(xiàn)代啤酒廠常采用如下流程制備無菌空氣。高空采氣→壓縮機(jī)→空氣冷凝器（使空氣溫度降至露點(diǎn)以下3℃—5℃）機(jī)械除水（冷干或吸附）→加熱升至常溫以上→2um過濾器除塵埃→0.4um過濾器→輸送

23、管道（不銹鋼）→用氣點(diǎn)→0.2um終端過濾→使用 各濾器定期用潔凈蒸汽殺菌。這樣可以做到<3個(gè)細(xì)菌/10L，可以認(rèn)為基本無菌。在啤酒生產(chǎn)中使用CO2和N2，也要走除水→膜頂過濾器→膜終過濾器后才能用于啤酒生產(chǎn)。,啤酒污染微生物的防治,釀造用水啤酒糖化投料水、洗糟水，并不需要無菌水，只需達(dá)到飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)即可。洗酵母水、頂啤酒用水，大罐管道消毒殺菌后最后沖洗水、高濃啤酒后稀釋水、純生啤酒硅藻土過濾調(diào)漿水都需要無菌水。深

24、井水中微生物很少，但經(jīng)過工廠蓄水池可能會(huì)繁殖，城市自來水大多經(jīng)過加氯處理，一般《102個(gè)/ml?，F(xiàn)在有些廠釀造水經(jīng)過簡單的砂濾棒或過濾機(jī)過濾就稱其為無菌水。砂濾棒依賴于表面微孔及棒壁厚度（深層）過濾。但它的除菌率僅85%—95%。其它如紙板過濾機(jī)會(huì)更低。若過濾前生物量高過104/ml，過濾后還有102/ml。純生啤酒使用的無菌水一般要經(jīng)過四級過濾：機(jī)械過濾→活性炭過濾→0.2—0.3um膜濾→高壓紫外線汞燈，它可以保證殺死水中病毒,

25、啤酒污染微生物的防治,冷卻麥汁煮沸麥汁是無菌的。在冷卻后期，由于冷卻薄板和冷卻麥汁輸送管道清洗不徹底，污垢中微生物可以污染麥汁，冷卻麥汁通入無菌空氣除菌不徹底也會(huì)引起污染麥汁。我國傳統(tǒng)控制指標(biāo)50個(gè)/ml是很低水平，有些廠還很難做到。國外要求冷卻麥汁5個(gè)/10ml，而且在進(jìn)罐前取樣。,啤酒污染微生物的防治,污垢在啤酒工藝管道、閥門及罐體中，常會(huì)有麥汁和麥汁中蛋白質(zhì)、酒花樹脂、聚酯、β—葡聚糖殘留，聚結(jié)形成污垢。在這污垢里容易由

26、酵母、細(xì)菌乃至霉菌繁殖。這些微生物繁殖，有的形成菌膜，有點(diǎn)形成菌核，使污垢更具有強(qiáng)粘著力，而且非常牢固。一般熱水、清洗劑很難完全清洗。無錫輕工大學(xué)工藝教研室在大罐頂部取污垢樣分析，污垢中微生物總量達(dá)105—107個(gè)/g?？梢哉J(rèn)為有污垢必有高量的微生物。（啤酒石也同樣）因此，釀造純生啤酒管路、閥門必須光滑易清洗，不銹鋼大罐罐體要拋光至0.7um的光潔度，清酒罐拋光要到達(dá)0.4um光潔度。,啤酒污染微生物的防治,要有良好的CIP。

27、在薄板至大罐采用CIP順序清洗時(shí)，其清洗劑流動(dòng)使必須達(dá)到Re>2000高度湍流，即在薄板和麥汁輸送管道清洗時(shí)，輸送流應(yīng)是麥汁輸送量的1.5倍—2.5倍，甚至出流速必須>2m/s,才能保證污染物被清洗下來。大罐清洗現(xiàn)在較多采用堿性清洗劑，在啤酒發(fā)酵中形成較多草酸，最后會(huì)形成草酸鈣結(jié)晶。發(fā)酵周期愈長，結(jié)晶愈多。一般要用堿性清洗劑才能除去。,管理清洗消毒程序及要求,設(shè)備清洗消毒程序及要求,啤酒污染微生物防治,種酵母泥啤酒廠純粹

28、培養(yǎng)種酵母一般可做到無污染，但經(jīng)發(fā)酵回收的種酵母泥就很難保證，特別是三代以后經(jīng)常染菌率>104個(gè)/g。因此釀制純生啤酒必須控制好種酵母泥的純度。禁止使用高代酵母泥，一般三代左右為宜?；厥辗N酵母泥如有染菌必須用酸洗。（H3PO4，PH=2.2—2.5酸洗2—3小時(shí)）或者應(yīng)用浴菌酶或乳酸鏈球菌肽殺死酵母泥中的雜菌。,啤酒污染微生物防治,其它輔助材料啤酒用硅藻土、硅膠、PVPP和一切后修飾劑也應(yīng)做到無細(xì)菌污染。,啤酒污染菌傳統(tǒng)檢測鑒

29、定技術(shù),傳統(tǒng)培養(yǎng)法是目前在各啤酒廠應(yīng)用最普遍的微生物檢驗(yàn)方法。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，成本較低。缺點(diǎn)：耗時(shí)較長。檢測厭氧菌需7—14天。結(jié)果嚴(yán)重滯后，并且無法確定污染菌的種類。要進(jìn)一步確定污染菌的種類，多是通過生理生化反應(yīng)或血清學(xué)試驗(yàn)，耗時(shí)很長。,常見商品化啤酒厭氧菌檢測培養(yǎng)基,啤酒污染菌的快速檢測鑒定技術(shù),為了更好地監(jiān)控啤酒生產(chǎn)的衛(wèi)生狀況，特別是純生啤酒的無菌釀造，迫切需要建立更加快速、高效、精確度高的微生物檢測鑒定體系。近年來，各種

30、各樣的微生物快速檢測鑒定技術(shù)被開發(fā)并應(yīng)用到啤酒釀造過程，大大加強(qiáng)了人們對污染微生物的監(jiān)控力度。這得益于一下兩方面的有機(jī)結(jié)合：對啤酒有害菌生理生化特性的進(jìn)一步認(rèn)識。對其它學(xué)科領(lǐng)域及行業(yè)的研究成果，特別是分子生物學(xué)技術(shù)的借鑒和利用。,啤酒污染微生物的研究進(jìn)展,1、能在啤酒中生長的細(xì)菌一般都具有耐酒花的特性。 啤酒對于絕大多數(shù)微生物都是營養(yǎng)貧乏，甚至是嚴(yán)劣的培養(yǎng)基。所含有的酒花苦味物質(zhì)對革蘭氏陽性菌有毒害性。幾乎所有的革蘭氏陽

31、性菌都是乳酸菌，但并不是所有的乳酸菌都能引起啤酒腐敗。因此，只有獲得耐酒花基因后才有能力在啤酒中生長、繁殖。,啤酒污染微生物的研究進(jìn)展,2、啤酒有害菌的VNC狀態(tài)即在酒液中實(shí)際存在，但在檢測培養(yǎng)基上不生長從而導(dǎo)致無法檢測出實(shí)際微生物狀況。除此之外，其生理生化狀態(tài)及對啤酒的腐敗危害性與其正常狀態(tài)完全一致！VNC狀態(tài)的誘導(dǎo)機(jī)制：是一種對啤酒釀造環(huán)境高度適應(yīng)性的結(jié)果。據(jù)目前研究表明，可能與有害菌獲得耐酒花特性而導(dǎo)致膜蛋白性質(zhì)的改變有關(guān)

32、聯(lián)。,啤酒污染微生物的研究進(jìn)展,VNC狀態(tài)導(dǎo)致的經(jīng)典案例：案例一：成品酒微檢測結(jié)果符合內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，但出廠后于貨架放置一段時(shí)間，有消費(fèi)者或者經(jīng)銷商投訴反饋混酒、爆瓶等質(zhì)量問題。案例二：品評成品酒時(shí)發(fā)現(xiàn)風(fēng)味嚴(yán)重異常，疑似有啤酒有害菌污染，但追蹤回顧生產(chǎn)流程微生物檢測結(jié)果又顯示符合內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，并無異常。案例三：跟蹤微檢結(jié)果顯示某種有害菌總是持續(xù)出現(xiàn)，但經(jīng)過一段時(shí)間后天然消失，再未被檢出，期間未經(jīng)過刷洗處理。,啤酒污染微生物的研究進(jìn)展,對某些

33、有害菌，特別是有害片球菌（俗稱四聯(lián)球菌）的檢出率低，生長緩慢，菌落微笑的狀況都可以歸納為VNC狀態(tài)。,啤酒污染微生物的研究進(jìn)展,針對啤酒污染微生物的VNC狀態(tài)日本朝日公司開發(fā)的ABD型培養(yǎng)基，無論是從檢出速度，還是檢出率都比傳統(tǒng)的培養(yǎng)基高出非常多。,啤酒污染菌的快速檢測鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展,分子檢測技術(shù)一：PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是美國人于1985年發(fā)明的一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)

34、。能在一個(gè)離心管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，可在6—12小時(shí)內(nèi)得出結(jié)果。是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)富有革新性的創(chuàng)舉，它非常適合啤酒中污染菌的快速檢測的要求。但它主要是依靠凝膠電泳條帶有無及大小位置來判定種類，存在假陽性的風(fēng)險(xiǎn)，并且多種菌同時(shí)判定時(shí)引物設(shè)計(jì)及操作都比較麻煩，不夠高效。,啤酒污染菌快速檢測鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展,分子檢測技術(shù)二：基因芯片技術(shù)基因芯片是90年代中期發(fā)展起來的一項(xiàng)前沿生

35、物技術(shù)。它是融合了物理學(xué)、微電子學(xué)、分子生物學(xué)、生命信息學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)等綜合交叉形成的高新技術(shù)，也成DNA芯片、生物芯片。其原理是將許多特定的寡聚核苷酸或DNA片段（稱為探針）固定在芯片每個(gè)預(yù)先設(shè)置的區(qū)域內(nèi)，將待測樣本標(biāo)記后同芯片進(jìn)行反應(yīng)，利用堿基互補(bǔ)配對原理進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號的有無及強(qiáng)弱來進(jìn)行結(jié)果判斷。因而具有極高的特異性和靈敏度。重復(fù)性好，效率高，最初主要應(yīng)用在醫(yī)學(xué)病源檢測領(lǐng)域。,啤酒污染菌的快速檢測鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展,基因

36、芯片技術(shù)在啤酒行業(yè)的應(yīng)用： 青啤在2006年利用PCR技術(shù)快速檢測啤酒污染菌的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上研制開發(fā)出一款啤酒專業(yè)有害菌鑒定檢測基因芯片。他們針對PCR擴(kuò)增出來的核酸序列，設(shè)計(jì)出每一種污染菌的特異性寡核苷酸探針并將之接種至空白基因芯片的表面。 通過提取未知污染菌的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增放大信號后與芯片進(jìn)行專一性的雜交反應(yīng)。通過判斷其PCR產(chǎn)物能否與特異性探針識別、配對來確定污染菌的種類。,啤酒污

37、染菌的快速檢測鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展,基因芯片技術(shù)的鑒定檢測范圍：啤酒釀造過程出現(xiàn)頻次最高的12種啤酒有害菌。其中乳酸桿菌屬： 6種巨球菌屬： 1種果膠桿菌屬： 2種片球菌屬： 3種,啤酒污染菌的快速檢測鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展,啤酒有害菌基因芯片驗(yàn)證結(jié)果利用12種啤酒有害菌及其它雜菌進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此芯片特異性高，假陽性為零，抗干擾能力強(qiáng)。啤酒有害菌基因芯片操作過程：

38、核酸萃取→PCR放大→芯片反應(yīng)雜交→清洗呈色→結(jié)果檢測判讀,啤酒污染菌的快速檢測鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展,啤酒有害菌基因芯片的特點(diǎn)快速： 5—6小時(shí)完成12種啤酒污染菌的同步檢測。高效： 可同時(shí)檢測96個(gè)樣品。精確： 通過結(jié)合三對引物及特異性探針可以鑒定到種，且可信度高。,啤酒污染菌的快速檢測鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展,熒光顯微自動(dòng)化計(jì)數(shù)法 應(yīng)用原理及特點(diǎn)：活細(xì)胞熒光染色加熒光顯微自動(dòng)化計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)。通過不

39、同染色方法分別對死、活細(xì)胞染色，然后進(jìn)行熒光顯微照相，利用軟件進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)，記錄大小，位置及每種菌落出現(xiàn)的頻次等統(tǒng)計(jì)分析。具有快速（40—50分鐘）、高效（整張濾膜）及能夠計(jì)算死亡率的特點(diǎn)。（這臺設(shè)備是朝日公司發(fā)明推廣的）,啤酒污染菌的快速檢測鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展,ATP熒光檢測法三磷酸腺苷（ATP）存在于所有動(dòng)植物、細(xì)菌、酵母菌、霉菌內(nèi)，食物殘留中也富含ATP，通過ATP釋放液破壞細(xì)胞壁使ATP釋放出來。當(dāng)ATP在熒光素酶的作用下與

40、熒光素結(jié)合時(shí)發(fā)出一種生物熒光。熒光量與ATP量成正比。該熒光被光電倍增管采集、測試，從而得知測試部位被細(xì)菌、食物殘留等污染程度。具有快速（30S）、操作簡單的特點(diǎn)。 無法精確定量及鑒定種類，檢測結(jié)果只與污染總菌數(shù)量有80—90%的相關(guān)性。,啤酒污染菌的快速檢測鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展,快速培養(yǎng)技術(shù) 品牌專業(yè)培養(yǎng)基： 近年來，很多啤酒釀造品牌根據(jù)自身啤酒廠微生物污染的特點(diǎn)和檢測需求開發(fā)、設(shè)計(jì)出本品牌專用的啤

41、酒有害菌培養(yǎng)基。相對于使用市售商業(yè)培養(yǎng)基來說，能更快速、更真實(shí)地反映本生產(chǎn)廠啤酒釀造的微生物污染狀況。（如AB的QA33 Miller 的 BNB 都是在3—5天培養(yǎng)出結(jié)果）,啤酒污染菌的快速檢測鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展,快速培養(yǎng)技術(shù) 目前國內(nèi)食品發(fā)酵研究院與青啤等單位都在開發(fā)啤酒有害菌快速檢測培養(yǎng)基。他們針對的目標(biāo)是：提高培養(yǎng)速度。使檢測時(shí)間縮短到2天內(nèi)。提高檢出率（針對VNC狀態(tài)）優(yōu)化對片球菌的培養(yǎng)效果。給有害