常規(guī)的普通實驗室檢測在肉雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用

1、常規(guī)的普通實驗室檢測在肉雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用,田 野,,細(xì)菌的革蘭氏染色常用抗菌藥物敏感性試驗金標(biāo)層析法檢測技術(shù)水的細(xì)菌學(xué)檢查,一、革蘭氏染色,1.革蘭氏染色機理 當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫一碘的復(fù)合物，從而增強了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用脫色劑處理時，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇(或丙酮)

2、脫色時細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇(或丙酮)溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。。,2.革蘭氏染色法的基本方法,先用初染劑結(jié)晶紫進行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脫色

3、，最后用復(fù)染劑(如番紅)復(fù)染。經(jīng)此方法染色后，細(xì)胞保留初染劑藍紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌；如果細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細(xì)菌染上復(fù)染劑的顏色(紅色)，該菌屬于革蘭氏陰性菌。,3.革蘭氏染色的步驟,1）、涂片：用1%鹽酸清潔玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸餾水，再用無菌操作的方法挑菌少許于玻片的水中，并充分混勻涂成薄膜。 2）、干燥：將涂片置火焰高處微熱烘干或自然干燥。 3）、固定：涂面朝上，通過微火2-3次。,涂片—風(fēng)干—固定—初

4、染—水洗—媒染—水洗—脫色—水洗—復(fù)染—水洗—干燥—鏡檢,,4）、染色： 結(jié)晶紫染色1分鐘--水洗--碘液媒染1-2分鐘--水洗--酒精脫色15-20秒--水洗--番紅復(fù)染色2-3分鐘--水洗--干燥--鏡檢記錄。,crystal violet stain wash with water,,,,,染色結(jié)果,金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合菌樣的革蘭氏染色結(jié)果,革蘭氏染色結(jié)果：陰（性）紅（

5、色）陽（性）紫（色）,染色結(jié)果,金黃色葡萄球菌革蘭氏染色結(jié)果,染色結(jié)果,大腸桿菌革蘭氏染色結(jié)果,,二、常用抗菌藥物敏感性試驗,抗菌藥物敏感性試驗（AST，簡稱藥敏試驗）：用于測試抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑制作用。,,（1）最低抑制濃度 （minimal inhibitory concentration ，MIC ） ：體外能夠抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度，臨床醫(yī)師可以根據(jù)MIC確定藥物劑量。通常達到穩(wěn)態(tài)的血藥峰濃度（Css）max應(yīng)

6、為MIC的4-8倍，重癥感染以大于8倍為妥。 （2）為方便臨床給藥，根據(jù)MIC提供一個定性的結(jié)果是必要的。臨床獸醫(yī)師根據(jù)敏感、中介、耐藥的提示結(jié)合MIC可以方便地制定用藥方案。,,敏感（S）：表示該藥物對細(xì)菌的MIC值低于常規(guī)劑量下的抗菌 藥物血液濃度或組織濃度4-8倍，可以用常規(guī)劑量治愈。 中介（I）：表示該藥物對細(xì)菌的MIC值接近于常規(guī)劑量給藥后的血藥濃度或組織藥物濃度，細(xì)菌對該藥的敏感性降低，但仍可用于生理性濃集部位

7、的感染或使用高劑量藥物進行治療（注：必須考慮高劑量的安全性）。 耐藥（R）：表示該藥物對細(xì)菌的MIC值等于或高于常規(guī)劑量下藥物的血液濃度或組織濃度，細(xì)菌不能被該種藥物抑制。,常用的藥敏測定方法,紙片擴散法（Kirby-Bauer test） 稀釋法（dilution test） E試驗法（E test） 聯(lián)合藥物敏感試驗,1、培養(yǎng)基,1、是兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基2、如營養(yǎng)要求高可加0.5%羊血。3、平

8、板直徑為9cm。4、瓊脂板厚度4mm。誤差±1mm。5、4℃保存7天。,,操作步驟：,1、玻璃器皿的準(zhǔn)備 沖洗、包裹、滅菌、干燥2、記量、稱取原料3、加熱溶解4、校正PH值5、滅菌6、分裝、包裹、備用,,,,2、藥敏片,1、單藥（一種成分） 市場生化試劑店有售，也可自制。但含量及監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)有嚴(yán)格界定。建議購買2、成藥（復(fù)方成分） 多種聯(lián)合的抗菌藥物制劑應(yīng)以其成分中某種含量最高的抗菌藥物為標(biāo)準(zhǔn)稀釋成有效濃度

9、。但多數(shù)廠家由于產(chǎn)品配方機密，多按產(chǎn)品用量進行配制。藥敏片可由廠家提供，也可自制。3、中藥草藥 將中藥研成粉未，1克加適量的水充分浸泡煮沸,濾液除去雜質(zhì)后濃縮成1毫升,過濾、高壓滅菌后加入100張紙片干燥備用。,制作步驟：1、紙片的準(zhǔn)備2、藥液的配制3、抗菌藥敏紙片制作,,,質(zhì)控：標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌圈直徑應(yīng)落在預(yù)期范圍內(nèi)，如果超出該范圍，應(yīng)視為失控而予以糾正。,簡易藥敏片的制法,紙片的準(zhǔn)備：1、取新華3號定性濾紙，用打孔機打成

10、6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅15-20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥。2、藥片吸水量的測定 在上述藥片用微量移液器進行滴加蒸餾水，最可使藥片完全浸透又不滴水為宜，最終計算出每片藥片的吸水量。一般常用直經(jīng)6mm的定性濾紙藥片吸水量為0.02ml。,藥液的制備（用于商品藥的試驗）：按獸藥說明書(或標(biāo)簽)上標(biāo)明的治療量的10-20倍比例配制藥液。如

11、某藥品：100g兌水100kg，表明該藥治療量為1g兌水1L，配制藥液時就是1g加50-100ml水或1L水加10-20g藥品，即為配制藥敏片所用的藥液濃度。抗菌藥的稀釋劑通常用純化水。,說明：不同廠家標(biāo)示成分及含量相同的成品制劑在用成品做成藥敏時常出現(xiàn)顯著差異（包括同一廠家生產(chǎn)）由于在進行成品制作時常加入一定量的輔助成份，其對藥敏試驗結(jié)果常造成較大影響，所以成品藥敏試驗結(jié)果并不能完全顯示成品的真實結(jié)果。不能用單藥的藥敏結(jié)果代替

12、成藥進行用藥。（標(biāo)示與真實成份及含量有很大差別）建議選用廠家提供的以成品主藥成份制作的藥敏片使用。中藥由于其成份復(fù)雜及獨特作用機理，藥敏試驗不能作為唯一的判定標(biāo)準(zhǔn)。,,說明：不同廠家標(biāo)示成分及含量相同的成品制劑在用成品做成藥敏時常出現(xiàn)顯著差異（包括同一廠家生產(chǎn)）由于在進行成品制作時常加入一定量的輔助成份，其對藥敏試驗結(jié)果常造成較大影響，所以成品藥敏試驗結(jié)果并不能完全顯示成品的真實結(jié)果。不能用單藥的藥敏結(jié)果代替成藥進行用藥。（標(biāo)

13、示與真實成份及含量有很大差別）建議選用廠家提供的以成品主藥成份制作的藥敏片使用。中藥由于其成份復(fù)雜及獨特作用機理，藥敏試驗不能作為唯一的判定標(biāo)準(zhǔn)。,,抗菌藥敏紙片制作：方法一: 按每張紙片飽和吸水量為0.02毫升計，在上述含有50片紙片的青霉素瓶內(nèi)加入藥液1毫升，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內(nèi)過夜，干燥后即密蓋。方法二： 1、將藥液盛于干凈

14、干燥的平皿中。然后將烘干的紙片逐片放入配制好的藥液中，置于4-8℃浸泡1-2小時，同時要注意翻動，使各紙片充分透藥液。 2、將浸泡好的藥敏片用鑷子夾出，放入另一干燥平皿中。置于恒溫箱中，溫度37℃，烘干12~24小時。（注意經(jīng)常翻動，避免藥敏片重疊粘連）。 3、將烘干好的藥敏片放入青霉素瓶內(nèi)進行保存。,,藥敏紙片的儲存：長期儲存應(yīng)于－20℃，日常使用的小量紙片可放在4℃，但應(yīng)至于含干燥劑的密封容器內(nèi)。使用時從低溫取

15、出后,放置平衡到室溫后才可打開，用完后應(yīng)立即將紙片放回冰箱內(nèi)的密封容器內(nèi)。 過期紙片不能使用, 應(yīng)棄去。,,（一）紙片擴散法（K-B法）,原理： 含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種細(xì)菌的瓊脂平板上，紙片所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷向紙片周圍區(qū)域擴散，形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的細(xì)菌生長被抑制，形成透明的抑菌圈。 抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑制濃度（MIC）呈負(fù)相

16、關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。,,1、細(xì)菌涂抹平板 在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。 具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細(xì)菌均勻密布于平皿。 （另：可挑取待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂

17、布均勻致密。）,2、貼藥片：,將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準(zhǔn)確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。,3、培養(yǎng),將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中倒置培養(yǎng)12-18小時后，觀察效果。,4、結(jié)果觀察：,在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴散

18、，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細(xì)菌生長受到抑制。培養(yǎng)一定時間后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細(xì)菌濃度有直接關(guān)系。,,,,,,,,,,,,,,抑菌圈邊緣分界清晰、內(nèi)部潔凈透明,說明該抗菌藥物作用迅速,多半為殺菌劑,邊緣不十分清晰、內(nèi)部朦朧說明該抗菌藥物可能是慢效抑菌劑或有耐藥的產(chǎn)生、或分解較快維持抗菌時間短。抑菌圈中分層

19、次形成同心年輪樣,可能是聯(lián)合使用抗菌藥物或該抗菌藥物失效過快或細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性。,抑菌圈的測量,用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄。抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細(xì)菌明顯生長為限。有的菌株可出現(xiàn)蔓延生長，進入抑菌環(huán)，磺胺藥在抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)輕微生長，這些都不作為抑菌環(huán)的邊緣。結(jié)果判斷依據(jù)鑒定所藥敏紙片判定標(biāo)準(zhǔn)。,,抑菌圈的測量,,報告的填寫,,,5、影響藥敏結(jié)果的因素,藥物因素細(xì)菌因素培養(yǎng)條件培養(yǎng)基藥敏片,藥

20、物因素藥物的溶解性 易溶于水的藥物易擴散，難溶性藥物就不易擴散藥物的穩(wěn)定性 如水解（某些β—內(nèi)酰胺類藥物）、PH值（青霉素鈉遇酸堿分解、紅霉素遇酸不穩(wěn)定）藥物的抗菌機理 殺菌藥物 環(huán)邊沿明晰 抑菌藥物 環(huán)邊沿模糊—細(xì)菌恢復(fù)生長—環(huán)縮小殺菌藥物 氨基糖苷類、喹諾酮類等。抑菌藥物 磺胺類、紅霉素類、林可霉素、四環(huán)素類、氯霉素類等離子的影響 喹諾酮類、四環(huán)素

21、類、泰樂菌素等藥物在Ca、Mg等陽離子的作用下（一般是形成不溶性絡(luò)合物）抗菌作用降低或喪失。適宜的PH值 氨基糖苷類在弱堿情況下抗菌作用稍有增強藥物在體內(nèi)外作用有別 只有在體內(nèi)進一步分解（或轉(zhuǎn)化）后才能表現(xiàn)出抗菌作用,,細(xì)菌因素細(xì)菌層的薄厚細(xì)菌的生長特性,培養(yǎng)基培養(yǎng)基厚度水的質(zhì)量PH值培養(yǎng)基成分,培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間的長短培養(yǎng)溫度,藥敏片藥物含量的多少試紙片材質(zhì),應(yīng)用,1、在選擇高敏藥物時還應(yīng)考慮藥物的吸收途徑。

22、高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法。2、藥敏試驗結(jié)果僅為臨床選擇高敏藥物的參考。藥敏試驗與臨床治療效果的符合率一般為70－80%。如發(fā)現(xiàn)療效不顯著應(yīng)及時換藥。3、藥敏試驗確定的首選藥物不是一成不變。要定期進行藥敏試驗。 4、窄譜抗生素能解決的問題不選廣譜抗生素，一種抗生素可達到治療作用時，不要用兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用。必須應(yīng)用兩種抗生素時，應(yīng)選擇聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用的藥物。5、避開已經(jīng)使用過的藥物或其同類藥物，發(fā)病期間已用過的藥物或同類

23、藥物一般不用。6、加強飼養(yǎng)管理，提高衛(wèi)生條件，能起到很好的輔助治療作用,,三、金標(biāo)層析法檢測技術(shù),金標(biāo)法，又稱免疫金標(biāo)記技術(shù)。是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。氯金酸在還原劑的作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金 。  金標(biāo)法又分為：層析法和斑點滲透法。 免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種成熟的免疫標(biāo)

24、記技術(shù)。膠體金標(biāo)記實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。,膠體金免疫層析法,將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。,（一）、金標(biāo)檢測試劑的

25、歷史,★ 1971年由Faulk 和Taytor發(fā)明，目前在醫(yī)學(xué)方面得到了日益廣泛的應(yīng)用?！?90年代傳入我國，已經(jīng)用于檢測 HBsAg（乙肝）、HCG（早孕） 、HIV（艾滋?。⒚范镜燃膊?，具有簡單、快速、準(zhǔn)確和無污染等優(yōu)點，我國已經(jīng)有幾十家藥廠生產(chǎn)醫(yī)學(xué)檢驗用的金標(biāo)試紙?！?目前，該項技術(shù)已開始應(yīng)用于藥物殘留和疫病等的檢測。,幾個概念：,1、什么是抗原抗原是能刺激機體產(chǎn)生抗體（免疫球蛋白，Ig）,并能與產(chǎn)生的抗體發(fā)生特

26、異性結(jié)合的物質(zhì)。醫(yī)學(xué)上重要的抗原有細(xì)菌（如NGH），病毒（如HBV、HCV、HIV），螺旋體（如TP），蛋白質(zhì)（如AFP）等。2、什么是抗體？抗體是能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白，是免疫應(yīng)答的產(chǎn)物。它與相對應(yīng)的抗原能發(fā)生特異性的結(jié)合（如鎖與鑰匙的關(guān)系一樣，一把鑰匙開一把鎖），與其他抗原不發(fā)生結(jié)合。 臨床上的免疫學(xué)檢測方法就是根據(jù)抗原抗體高度特異性結(jié)合的原理設(shè)計?？梢杂靡阎目乖瓩z測未知的抗體，

27、也可用已知的抗體檢測未知的抗原。,（二）、金標(biāo)檢測技術(shù)的基本原理,金標(biāo)免疫檢測試紙條系統(tǒng)使用一種特殊的多孔膜（NC膜）作為固相載體。該膜具有很強的蛋白吸附功能，抗體抗原吸附于NC膜并經(jīng)干燥處理后即作為固相，可與液相中的相應(yīng)標(biāo)記了膠體金的抗原抗體快速結(jié)合?！　?在濕潤狀態(tài)下，液相中的抗原抗體免疫金可因“燈芯引流現(xiàn)象”作快速定向泳動并與固相另一抗原決定簇單抗結(jié)合，形成特異的金標(biāo)記抗體－抗原－抗體紅色沉積線，表現(xiàn)出抗

28、原抗體的特征反應(yīng)。,金標(biāo)試紙條工作原理,是將各種反應(yīng)試劑以條帶狀固定在同一試紙條上，待檢標(biāo)本加在試紙條的一端，將一種試劑溶解后，通過毛細(xì)作用在層析條上滲濾、移行并與膜上另一種試劑接觸，樣品中的待測物同層析材料上針對待測物的受體（如抗原或抗體）發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。層析過程中免疫復(fù)合物被截留、聚集在層析材料的一定區(qū)域（檢測帶），通過可目測的膠體金標(biāo)記物得到直觀的顯色結(jié)果。而游離標(biāo)記物則越過檢測帶，達到與結(jié)合標(biāo)記物自動分離之目的。,金標(biāo)免疫檢

29、測試紙條的結(jié)構(gòu),主體的膜反應(yīng)體系由以下部分組成：1： 高蛋白親和性的高分子纖維素膜（NC膜），為反應(yīng)膜用來作為系統(tǒng)反應(yīng)的載體和顯示反應(yīng)結(jié)果。2：選用有較強吸水能力的玻璃纖維，經(jīng)特殊處理后，為反應(yīng)系統(tǒng)提供適合的反應(yīng)條件，并幫助吸水。 3：吸附力較強的玻璃纖維，作為金標(biāo)記物的固相載體。 4：吸收墊，吸水，牽引反應(yīng)物的運動。5：塑料基板，作為反應(yīng)體系的支撐物。,金標(biāo)檢測技術(shù)的基本原理,氯金酸(HAuCl4)在還原劑（檸檬酸）作用下，

30、可使金離子還原成金原子，并聚合成一定大小的金顆粒，形成一種膠體溶液。把這種溶液稱為膠體金。 膠體金具有很大的表面積，可將抗原、抗體等蛋白質(zhì)吸附到膠體金顆粒表面。,吸附的機理是膠體金顆粒表面帶負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固的結(jié)合。,,在玻纖上噴抗原標(biāo)記的金顆粒,,標(biāo)記抗原的金顆粒,,玻纖,,在纖維素膜上噴AIV抗體,纖維素膜,抗體,,,,以AIV為例,試劑條組裝,被標(biāo)記的金顆粒,抗體,樣品墊,濾紙,,,,,AIV

31、金標(biāo)試紙條的工作原理,加入樣品,樣品流動,,,樣品中沒有AIV時：,T線,,金顆粒上的AIV和纖維素膜上的抗體結(jié)合，金顆粒聚集在一起，形成紅色的條帶，結(jié)果為陰性。,樣品中有高濃度的AIV時：,,由于樣品中AIV的分子數(shù)量很多，大大多于金顆粒上的AIV ，抗體上都結(jié)合了樣品中的AIV ，而金顆粒不能結(jié)合到抗體上，造成金顆粒穿過抗體條帶到濾紙上，纖維素膜上為白色。,AIV分子,,,T線,樣品中含有少量的AIV時：如0.13HAU,,樣品中A

32、IV分子較少時，和交聯(lián)在金顆粒上的AIV互相競爭，有少量的金顆粒吸附在纖維素膜上，行成顏色較淺的T線。,T線,在醫(yī)學(xué)上使用的各種金標(biāo)試紙條，如艾滋病、乙肝、海洛因等檢測試紙條，要求非常嚴(yán)格。纖維素膜上除噴上抗體形成T線（Test）外，還噴有形成C線（Control）的抗體。 C線應(yīng)在檢測過程中的任何情況下都應(yīng)該出現(xiàn)，否則就證明試紙條在運輸、保存等過程中發(fā)生了意外情況，如高溫、潮濕等，導(dǎo)致試劑條失效。這樣就有了一個試劑本身

33、質(zhì)量的判定標(biāo)準(zhǔn)，避免由于試劑保存等原因造成的假陽性或假陰性等情況的出現(xiàn)。,,,,,,,,T線,C線,這樣，在高濃度的情況下，即使T線不出現(xiàn)，只要C 線出現(xiàn)，就知道試劑沒有問題。而如果連C線都沒有，則可知道是試劑有問題，該包裝的試劑應(yīng)該棄用。這樣就避免了假陽性的結(jié)果。,,檢測原理示意圖,膠體金顆粒表面包被有可以識別待測藥物的抗體檢測線包被有藥物-BSA偶聯(lián)物，可以識別膠體金上的抗體質(zhì)控線包被有可結(jié)合膠體金顆粒的抗體,(三)、禽流感金標(biāo)

34、試劑的使用(深圳真瑞生物科技有限公司),產(chǎn)品可于室溫下陰涼避光干燥處貯存，有效期12個月（無需在冰箱中保存）。 檢測閾值：0.13 HAU檢測不需要其它任何的輔助儀器,使用方法,,,,,,,操作步驟1. 檢測準(zhǔn)備,（1） 根據(jù)檢測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量確定需要 的試紙條數(shù)量，并取出；（2）在金標(biāo)試劑空白處寫上樣品編號。,寫編號,,,2、操作步驟,第一步：在室溫下，將測試卡平放在桌面上；

35、第二步：用試劑包裝中所帶的塑料吸管吸取檢測樣品或其它提取樣品；第三步：在加樣孔中滴五滴樣品，5分鐘內(nèi)判讀結(jié)果。,結(jié)果判讀,,陽性（－）：T 線和C 線都顯色，表示樣品中AIV濃度高于檢測限。陰性（＋）：T 線無顯色C 線顯色，表示樣品中AIV濃度低于檢測限。無 效 ：未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過程或試紙卡已變質(zhì)失效。在此情況下，應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說明書，并用新的試紙卡重新測試。,,杰出的應(yīng)用價值,AIV抗原快速檢測卡的設(shè)計使得結(jié)果

36、清晰易判。優(yōu)化的工藝使得即使弱陽性的樣本也能呈現(xiàn)出清晰的檢測線。AIV抗原檢測卡的諸多特性有助于我們獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果、高效的檢測效率和經(jīng)濟的檢測費用。,準(zhǔn)確的檢測結(jié)果,準(zhǔn)確率96.8%如下毒株的檢測都成陽性反應(yīng),高效的檢測效率,操作簡單結(jié)果易判15分鐘出結(jié)果可單份檢測,經(jīng)濟的檢測費用,檢測卡的成本遠(yuǎn)低于PCR試劑可單份檢測，試劑利用率100%可現(xiàn)場檢測，不需儀器室溫儲存，不需冷鏈有效期長達18個月可檢測多種樣本：

37、咽喉、泄殖腔拭子或糞便,四、水的細(xì)菌學(xué)檢查,生活用水的水源常被生活污水或工業(yè)廢水或人與動物的糞便所污染，可能含有不同類型的微生物，有腐生性的和病原性的。腐生性微生物對人無害，而病原性微生物則能引起傳染病的發(fā)生。必須對生活用水及其水源進行嚴(yán)格的細(xì)菌學(xué)檢查。 測定水樣是否合乎飲用標(biāo)準(zhǔn)，通常包括下列兩個項目： ◇細(xì)菌總數(shù)測定 ◇大腸菌群的測定,,（一）細(xì)菌總數(shù)測定,水中細(xì)菌總數(shù)可說明被有機物污染的程度。細(xì)菌數(shù)越多

38、，有機物質(zhì)含量越大。腸道中的絕大多數(shù)腐生性和致病性的細(xì)菌，可在營養(yǎng)豐富的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進行生長，出現(xiàn)肉眼可見的菌落。 細(xì)菌總數(shù)是指1 ml水樣在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃、24小時培養(yǎng)后，所生長的菌落數(shù)。 我國規(guī)定1 ml自來水中的總菌數(shù)不得超過100個,,1. 水樣采集自來水 將自來水龍頭用火焰燒灼3min滅菌，再擰開水龍頭流水5min，以排除管道內(nèi)積存的死水，隨后用

39、已滅菌的三角瓶接取水樣，以供檢測。池水、河水或湖水 將無菌的帶玻塞的小口瓶浸入距水面10～15cm深的水層中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中裝滿后，蓋好瓶塞，取出后立即進行檢測，或臨時存于冰箱，但不能超過24h。,,2.細(xì)菌總數(shù)的測定 1)自來水 2)池塘水、河水或湖水 操作步驟 編號 水樣稀釋 取樣 傾注平板 培養(yǎng) 計數(shù),操作步驟,1）編號： 取無菌培養(yǎng)皿9套，每3

40、套為一組，在每組皿底分別寫上10－1 、 10－2 、10－3 。另取3支無菌空試管排列于試管架上，依次標(biāo)明10－1 、 10－2 、 10－3 ，并向試管中各加入9ml無菌生理鹽水。,,2）水樣稀釋 取1ml水樣加入到9ml無菌水的試管，振蕩混勻，得稀釋度為10－1； 從10－1管中取水樣1ml加到第二支9ml無菌水的管中，振蕩混勻，得10－2，重復(fù)上述操作，直至制成10－3稀釋液。,,3）取樣：用三支1ml無菌吸管分別吸

41、取10-1、10-2和10-3稀釋液各1ml，對號放入編好號的無菌培養(yǎng)皿中。4）傾注平板：盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每皿約15ml，置水平位置迅速旋轉(zhuǎn)平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出或濺到皿蓋上。5）培養(yǎng)：待培養(yǎng)基凝固后，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。,,6）菌落計數(shù)方法 ①計算相同稀釋度的平均菌落數(shù) 。 ②選擇平均菌落數(shù)在30～300之間稀釋

42、度的平板。當(dāng)只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，則以該平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，作為該水樣的細(xì)菌總數(shù)進行報告。,,③若有兩個稀釋度的平均菌落數(shù)均在30～300之間，則按兩個稀釋度菌落總數(shù)的比值來決定取數(shù)。如比值小于2，應(yīng)取兩者的平均數(shù)；如比值大于2，則取其中較小的菌落總數(shù)進行報告。 ④若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)進行。,,⑤若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則按稀釋度最低的平均

43、菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)進行報告。 ⑥若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，則以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)進行報告。,,,（二）大腸菌群的測定,若水源被糞便污染，則有可能也被腸道病原菌污染，然而腸道病原菌在水中容易死亡與變異，因此數(shù)量較少，要從中特別是自來水中分離出病原菌常較困難與費時，這樣就要找到一個合適的指示菌，此指示菌要求是大量出現(xiàn)在糞便中的非病原菌，并且和水源病原菌相比是較易檢出的。,,若指

44、示菌在水中不存在或數(shù)量很少，則大多數(shù)情況也保證沒有病原菌。最廣泛應(yīng)用的指示菌是大腸菌群(coliform group)大腸菌群的定義是：一群好氧和兼性厭氧、革蘭氏陰性、無芽胞的桿狀細(xì)菌，并在乳糖培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃，24～48 h培養(yǎng)能產(chǎn)酸產(chǎn)氣。根據(jù)水中大腸菌群的數(shù)目來判斷水源是否被糞便所污染，并間接推測水源受腸道病原菌污染的可能性。,,我國規(guī)定每升自來水中大腸菌群數(shù)不超過3個；若只經(jīng)過加氯消毒即供作生活飲用水的水源水，大腸菌群數(shù)

45、平均每升不得超過1000 個；經(jīng)過凈化處理及加氯消毒后供作生活飲用水的水源水，其大腸菌群數(shù)平均每升不得超過10000 個,,檢查大腸菌群的方法有多管發(fā)酵法與濾膜法兩種。多管發(fā)酵法使用歷史較久，又稱水的標(biāo)準(zhǔn)分析方法，為我國大多數(shù)衛(wèi)生單位與水廠所采用；濾膜法是一種快速的替代方法，而且結(jié)果重復(fù)性好，又能測定大體積的水樣，目前國內(nèi)已有很多大城市的水廠采用此法。,,多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群的原理 多管發(fā)酵法包括：初發(fā)酵試驗

46、、平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗三部分。,,1. 水樣采集自來水 將自來水龍頭用火焰燒灼3 min滅菌，再擰開水龍頭流水5 min，以排除管道內(nèi)積存的死水，隨后用已滅菌的三角瓶接取水樣，以供檢測。池水、河水或湖水 將無菌的帶玻塞的小口瓶浸入距水面10～15 cm深的水層中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中裝滿后，蓋好瓶塞，取出后立即進行檢測，或臨時存于冰箱，但不能超過24 h。,,2．初發(fā)酵試驗 液體培養(yǎng)基含有乳糖、蛋白

47、胨和溴甲酚紫。 乳糖起選擇性碳源的作用，大腸菌群可發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸（有機酸），產(chǎn)氣（CO2+H2）。 溴甲酚紫是pH指示劑（堿性條件：紫藍色；酸性條件：黃色，變色點pH=6.7）。 將水樣接種在具倒置杜漢氏小管的發(fā)酵管內(nèi)，于37℃下培養(yǎng)，24h后杜漢氏小管的頂端出現(xiàn)氣泡，表明有氣體產(chǎn)生，培養(yǎng)基混濁，顏色變黃，說明水中存在大腸菌群，視為陽性結(jié)果。,,用細(xì)口瓶取池塘水、河水或湖水的水樣（1）將1 ml 原水樣直接加入

48、10 ml 單倍乳糖培養(yǎng)基試管1支。（2）用蒸餾水稀釋原水樣成10-1 ，取1 ml 直接加入10 ml 單倍乳糖培養(yǎng)基試管1支。 （3）將10 ml 原水樣直接加入含5 ml 3倍乳糖培養(yǎng)基大試管1支。（4）將100 ml 原水樣直接加入含50 ml 3倍乳糖培養(yǎng)基三角瓶1個。,,如有下列情況的出現(xiàn)，其結(jié)果判斷需謹(jǐn)慎（1）個別其他類型的細(xì)菌在上述條件下也可能產(chǎn)氣，需進行下述試驗（即平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗）才能進一步確證。 （

49、2）培養(yǎng)24h后產(chǎn)酸，但未見產(chǎn)氣者，不能立即判斷為陰性結(jié)果，由于菌量少，也可能延遲至48h后才產(chǎn)氣，應(yīng)視為可疑結(jié)果，也需進行下述試驗（即平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗）進一步確證，48h后仍不產(chǎn)氣，可判斷為陰性結(jié)果。,,3．平板分離 平板分離用培養(yǎng)基通常為：伊紅美藍瓊脂（eosin methylene blue agar， EMB agar），復(fù)紅亞硫酸鈉瓊脂（亦稱遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基Endo’s medium）。,,（1）伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基中

50、含有伊紅與美藍這兩種苯胺類染料，它們不但可以抑制G+菌和一些難培養(yǎng)的G-菌，而且在低酸度時，兩種染料結(jié)合形成沉淀，起著產(chǎn)酸指示劑的作用。大腸菌群因其強烈發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生大量的混合酸，使菌體表面帶上正電荷，可染上伊紅染料，伊紅與美藍結(jié)合，菌體被著上深紫色，在含有兩種染料呈紫色的培養(yǎng)基上，形成帶核心、具金屬光澤的菌落。,,①深紫黑色、有金屬光澤。②紫黑色、不帶或略帶金屬光澤。③淡紫紅色、中心顏色較深。在伊紅美藍這種鑒別性培養(yǎng)基上，大腸

51、菌群呈現(xiàn)特征性菌落，因此，凡是出現(xiàn)這種菌落可確認(rèn)為是大腸菌群。,,24h和48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的初發(fā)酵菌落均需在上述培養(yǎng)基中的一種，進行平板劃線，分離出陽性菌落。 4．復(fù)發(fā)酵試驗 陽性菌落經(jīng)涂片染色鑒別為G-，無芽孢者，再經(jīng)過乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基進行復(fù)發(fā)酵試驗，經(jīng)24h培養(yǎng)產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，可確認(rèn)為大腸菌群陽性結(jié)果。,,,,,5.結(jié)果： 凡是在乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，在指示性培養(yǎng)基上能生長的，革蘭氏染色為陰性的無芽孢

52、桿菌，在復(fù)發(fā)酵管中產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的，即說明有大腸菌群的細(xì)菌存在—大腸菌群陽性；有一項不符的，即說明無大腸菌群的細(xì)菌存在—大腸菌群陰性。根據(jù)有大腸桿菌細(xì)菌存在的初發(fā)酵管的管數(shù)，查相應(yīng)的大腸桿菌檢索表，報告每100毫升待檢樣品中大腸菌群細(xì)菌的最近似數(shù)。,大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表,大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表,,,參考文件：細(xì)菌的革蘭氏染色法.ppt藥敏試驗(擴散法)操作方法.ppt金標(biāo)快速檢測試劑卡檢測技術(shù).ppt現(xiàn)代免