常規(guī)的普通實驗室檢測在肉雞養(yǎng)殖中的應用

1、常規(guī)的普通實驗室檢測在肉雞養(yǎng)殖中的應用,田 野,,細菌的革蘭氏染色常用抗菌藥物敏感性試驗金標層析法檢測技術水的細菌學檢查,一、革蘭氏染色,1.革蘭氏染色機理 當用結晶紫初染后，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結晶紫結合成結晶紫一碘的復合物，從而增強了染料與細菌的結合力。當用脫色劑處理時，兩類細菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結構組成，壁厚、類脂質含量低，用乙醇(或丙酮)

2、脫色時細胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結構孔徑縮小，透性降低，從而使結晶紫-碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當脫色處理時，類脂質被乙醇(或丙酮)溶解，細胞壁透性增大，使結晶紫-碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的紅色。。,2.革蘭氏染色法的基本方法,先用初染劑結晶紫進行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脫色

3、，最后用復染劑(如番紅)復染。經(jīng)此方法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色(紅色)，該菌屬于革蘭氏陰性菌。,3.革蘭氏染色的步驟,1）、涂片：用1%鹽酸清潔玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸餾水，再用無菌操作的方法挑菌少許于玻片的水中，并充分混勻涂成薄膜。 2）、干燥：將涂片置火焰高處微熱烘干或自然干燥。 3）、固定：涂面朝上，通過微火2-3次。,涂片—風干—固定—初

4、染—水洗—媒染—水洗—脫色—水洗—復染—水洗—干燥—鏡檢,,4）、染色： 結晶紫染色1分鐘--水洗--碘液媒染1-2分鐘--水洗--酒精脫色15-20秒--水洗--番紅復染色2-3分鐘--水洗--干燥--鏡檢記錄。,crystal violet stain wash with water,,,,,染色結果,金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合菌樣的革蘭氏染色結果,革蘭氏染色結果：陰（性）紅（

5、色）陽（性）紫（色）,染色結果,金黃色葡萄球菌革蘭氏染色結果,染色結果,大腸桿菌革蘭氏染色結果,,二、常用抗菌藥物敏感性試驗,抗菌藥物敏感性試驗（AST，簡稱藥敏試驗）：用于測試抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑制作用。,,（1）最低抑制濃度 （minimal inhibitory concentration ，MIC ） ：體外能夠抑制細菌生長的最低藥物濃度，臨床醫(yī)師可以根據(jù)MIC確定藥物劑量。通常達到穩(wěn)態(tài)的血藥峰濃度（Css）max應

6、為MIC的4-8倍，重癥感染以大于8倍為妥。 （2）為方便臨床給藥，根據(jù)MIC提供一個定性的結果是必要的。臨床獸醫(yī)師根據(jù)敏感、中介、耐藥的提示結合MIC可以方便地制定用藥方案。,,敏感（S）：表示該藥物對細菌的MIC值低于常規(guī)劑量下的抗菌 藥物血液濃度或組織濃度4-8倍，可以用常規(guī)劑量治愈。 中介（I）：表示該藥物對細菌的MIC值接近于常規(guī)劑量給藥后的血藥濃度或組織藥物濃度，細菌對該藥的敏感性降低，但仍可用于生理性濃集部位

7、的感染或使用高劑量藥物進行治療（注：必須考慮高劑量的安全性）。 耐藥（R）：表示該藥物對細菌的MIC值等于或高于常規(guī)劑量下藥物的血液濃度或組織濃度，細菌不能被該種藥物抑制。,常用的藥敏測定方法,紙片擴散法（Kirby-Bauer test） 稀釋法（dilution test） E試驗法（E test） 聯(lián)合藥物敏感試驗,1、培養(yǎng)基,1、是兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗標準培養(yǎng)基2、如營養(yǎng)要求高可加0.5%羊血。3、平

8、板直徑為9cm。4、瓊脂板厚度4mm。誤差±1mm。5、4℃保存7天。,,操作步驟：,1、玻璃器皿的準備 沖洗、包裹、滅菌、干燥2、記量、稱取原料3、加熱溶解4、校正PH值5、滅菌6、分裝、包裹、備用,,,,2、藥敏片,1、單藥（一種成分） 市場生化試劑店有售，也可自制。但含量及監(jiān)測標準有嚴格界定。建議購買2、成藥（復方成分） 多種聯(lián)合的抗菌藥物制劑應以其成分中某種含量最高的抗菌藥物為標準稀釋成有效濃度

9、。但多數(shù)廠家由于產(chǎn)品配方機密，多按產(chǎn)品用量進行配制。藥敏片可由廠家提供，也可自制。3、中藥草藥 將中藥研成粉未，1克加適量的水充分浸泡煮沸,濾液除去雜質后濃縮成1毫升,過濾、高壓滅菌后加入100張紙片干燥備用。,制作步驟：1、紙片的準備2、藥液的配制3、抗菌藥敏紙片制作,,,質控：標準菌株的抑菌圈直徑應落在預期范圍內(nèi)，如果超出該范圍，應視為失控而予以糾正。,簡易藥敏片的制法,紙片的準備：1、取新華3號定性濾紙，用打孔機打成

10、6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅15-20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥。2、藥片吸水量的測定 在上述藥片用微量移液器進行滴加蒸餾水，最可使藥片完全浸透又不滴水為宜，最終計算出每片藥片的吸水量。一般常用直經(jīng)6mm的定性濾紙藥片吸水量為0.02ml。,藥液的制備（用于商品藥的試驗）：按獸藥說明書(或標簽)上標明的治療量的10-20倍比例配制藥液。如

11、某藥品：100g兌水100kg，表明該藥治療量為1g兌水1L，配制藥液時就是1g加50-100ml水或1L水加10-20g藥品，即為配制藥敏片所用的藥液濃度?？咕幍南♂寗┩ǔＳ眉兓?。,說明：不同廠家標示成分及含量相同的成品制劑在用成品做成藥敏時常出現(xiàn)顯著差異（包括同一廠家生產(chǎn)）由于在進行成品制作時常加入一定量的輔助成份，其對藥敏試驗結果常造成較大影響，所以成品藥敏試驗結果并不能完全顯示成品的真實結果。不能用單藥的藥敏結果代替

12、成藥進行用藥。（標示與真實成份及含量有很大差別）建議選用廠家提供的以成品主藥成份制作的藥敏片使用。中藥由于其成份復雜及獨特作用機理，藥敏試驗不能作為唯一的判定標準。,,說明：不同廠家標示成分及含量相同的成品制劑在用成品做成藥敏時常出現(xiàn)顯著差異（包括同一廠家生產(chǎn)）由于在進行成品制作時常加入一定量的輔助成份，其對藥敏試驗結果常造成較大影響，所以成品藥敏試驗結果并不能完全顯示成品的真實結果。不能用單藥的藥敏結果代替成藥進行用藥。（標

13、示與真實成份及含量有很大差別）建議選用廠家提供的以成品主藥成份制作的藥敏片使用。中藥由于其成份復雜及獨特作用機理，藥敏試驗不能作為唯一的判定標準。,,抗菌藥敏紙片制作：方法一: 按每張紙片飽和吸水量為0.02毫升計，在上述含有50片紙片的青霉素瓶內(nèi)加入藥液1毫升，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內(nèi)過夜，干燥后即密蓋。方法二： 1、將藥液盛于干凈

14、干燥的平皿中。然后將烘干的紙片逐片放入配制好的藥液中，置于4-8℃浸泡1-2小時，同時要注意翻動，使各紙片充分透藥液。 2、將浸泡好的藥敏片用鑷子夾出，放入另一干燥平皿中。置于恒溫箱中，溫度37℃，烘干12~24小時。（注意經(jīng)常翻動，避免藥敏片重疊粘連）。 3、將烘干好的藥敏片放入青霉素瓶內(nèi)進行保存。,,藥敏紙片的儲存：長期儲存應于－20℃，日常使用的小量紙片可放在4℃，但應至于含干燥劑的密封容器內(nèi)。使用時從低溫取

15、出后,放置平衡到室溫后才可打開，用完后應立即將紙片放回冰箱內(nèi)的密封容器內(nèi)。 過期紙片不能使用, 應棄去。,,（一）紙片擴散法（K-B法）,原理： 含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種細菌的瓊脂平板上，紙片所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷向紙片周圍區(qū)域擴散，形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的細菌生長被抑制，形成透明的抑菌圈。 抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑制濃度（MIC）呈負相

16、關，即抑菌圈愈大，MIC愈小。,,1、細菌涂抹平板 在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。 具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。 （另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂

17、布均勻致密。）,2、貼藥片：,將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。,3、培養(yǎng),將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中倒置培養(yǎng)12-18小時后，觀察效果。,4、結果觀察：,在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴散

18、，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細菌生長受到抑制。培養(yǎng)一定時間后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關系。,,,,,,,,,,,,,,抑菌圈邊緣分界清晰、內(nèi)部潔凈透明,說明該抗菌藥物作用迅速,多半為殺菌劑,邊緣不十分清晰、內(nèi)部朦朧說明該抗菌藥物可能是慢效抑菌劑或有耐藥的產(chǎn)生、或分解較快維持抗菌時間短。抑菌圈中分層

19、次形成同心年輪樣,可能是聯(lián)合使用抗菌藥物或該抗菌藥物失效過快或細菌產(chǎn)生了耐藥性。,抑菌圈的測量,用游標卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄。抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。有的菌株可出現(xiàn)蔓延生長，進入抑菌環(huán)，磺胺藥在抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)輕微生長，這些都不作為抑菌環(huán)的邊緣。結果判斷依據(jù)鑒定所藥敏紙片判定標準。,,抑菌圈的測量,,報告的填寫,,,5、影響藥敏結果的因素,藥物因素細菌因素培養(yǎng)條件培養(yǎng)基藥敏片,藥

20、物因素藥物的溶解性 易溶于水的藥物易擴散，難溶性藥物就不易擴散藥物的穩(wěn)定性 如水解（某些β—內(nèi)酰胺類藥物）、PH值（青霉素鈉遇酸堿分解、紅霉素遇酸不穩(wěn)定）藥物的抗菌機理 殺菌藥物 環(huán)邊沿明晰 抑菌藥物 環(huán)邊沿模糊—細菌恢復生長—環(huán)縮小殺菌藥物 氨基糖苷類、喹諾酮類等。抑菌藥物 磺胺類、紅霉素類、林可霉素、四環(huán)素類、氯霉素類等離子的影響 喹諾酮類、四環(huán)素

21、類、泰樂菌素等藥物在Ca、Mg等陽離子的作用下（一般是形成不溶性絡合物）抗菌作用降低或喪失。適宜的PH值 氨基糖苷類在弱堿情況下抗菌作用稍有增強藥物在體內(nèi)外作用有別 只有在體內(nèi)進一步分解（或轉化）后才能表現(xiàn)出抗菌作用,,細菌因素細菌層的薄厚細菌的生長特性,培養(yǎng)基培養(yǎng)基厚度水的質量PH值培養(yǎng)基成分,培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間的長短培養(yǎng)溫度,藥敏片藥物含量的多少試紙片材質,應用,1、在選擇高敏藥物時還應考慮藥物的吸收途徑。

22、高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法。2、藥敏試驗結果僅為臨床選擇高敏藥物的參考。藥敏試驗與臨床治療效果的符合率一般為70－80%。如發(fā)現(xiàn)療效不顯著應及時換藥。3、藥敏試驗確定的首選藥物不是一成不變。要定期進行藥敏試驗。 4、窄譜抗生素能解決的問題不選廣譜抗生素，一種抗生素可達到治療作用時，不要用兩種藥物聯(lián)合應用。必須應用兩種抗生素時，應選擇聯(lián)合應用具有協(xié)同作用的藥物。5、避開已經(jīng)使用過的藥物或其同類藥物，發(fā)病期間已用過的藥物或同類

23、藥物一般不用。6、加強飼養(yǎng)管理，提高衛(wèi)生條件，能起到很好的輔助治療作用,,三、金標層析法檢測技術,金標法，又稱免疫金標記技術。是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。氯金酸在還原劑的作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金 。  金標法又分為：層析法和斑點滲透法。 免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種成熟的免疫標

24、記技術。膠體金標記實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。,膠體金免疫層析法,將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記試劑后相互反應，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標試劑的結合物又與之發(fā)生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結果。,（一）、金標檢測試劑的

25、歷史,★ 1971年由Faulk 和Taytor發(fā)明，目前在醫(yī)學方面得到了日益廣泛的應用?！?90年代傳入我國，已經(jīng)用于檢測 HBsAg（乙肝）、HCG（早孕） 、HIV（艾滋病）、梅毒等疾病，具有簡單、快速、準確和無污染等優(yōu)點，我國已經(jīng)有幾十家藥廠生產(chǎn)醫(yī)學檢驗用的金標試紙?！?目前，該項技術已開始應用于藥物殘留和疫病等的檢測。,幾個概念：,1、什么是抗原抗原是能刺激機體產(chǎn)生抗體（免疫球蛋白，Ig）,并能與產(chǎn)生的抗體發(fā)生特

26、異性結合的物質。醫(yī)學上重要的抗原有細菌（如NGH），病毒（如HBV、HCV、HIV），螺旋體（如TP），蛋白質（如AFP）等。2、什么是抗體？抗體是能與抗原發(fā)生特異性結合的免疫球蛋白，是免疫應答的產(chǎn)物。它與相對應的抗原能發(fā)生特異性的結合（如鎖與鑰匙的關系一樣，一把鑰匙開一把鎖），與其他抗原不發(fā)生結合。 臨床上的免疫學檢測方法就是根據(jù)抗原抗體高度特異性結合的原理設計?？梢杂靡阎目乖瓩z測未知的抗體，

27、也可用已知的抗體檢測未知的抗原。,（二）、金標檢測技術的基本原理,金標免疫檢測試紙條系統(tǒng)使用一種特殊的多孔膜（NC膜）作為固相載體。該膜具有很強的蛋白吸附功能，抗體抗原吸附于NC膜并經(jīng)干燥處理后即作為固相，可與液相中的相應標記了膠體金的抗原抗體快速結合。　　 在濕潤狀態(tài)下，液相中的抗原抗體免疫金可因“燈芯引流現(xiàn)象”作快速定向泳動并與固相另一抗原決定簇單抗結合，形成特異的金標記抗體－抗原－抗體紅色沉積線，表現(xiàn)出抗

28、原抗體的特征反應。,金標試紙條工作原理,是將各種反應試劑以條帶狀固定在同一試紙條上，待檢標本加在試紙條的一端，將一種試劑溶解后，通過毛細作用在層析條上滲濾、移行并與膜上另一種試劑接觸，樣品中的待測物同層析材料上針對待測物的受體（如抗原或抗體）發(fā)生特異性免疫反應。層析過程中免疫復合物被截留、聚集在層析材料的一定區(qū)域（檢測帶），通過可目測的膠體金標記物得到直觀的顯色結果。而游離標記物則越過檢測帶，達到與結合標記物自動分離之目的。,金標免疫檢

29、測試紙條的結構,主體的膜反應體系由以下部分組成：1： 高蛋白親和性的高分子纖維素膜（NC膜），為反應膜用來作為系統(tǒng)反應的載體和顯示反應結果。2：選用有較強吸水能力的玻璃纖維，經(jīng)特殊處理后，為反應系統(tǒng)提供適合的反應條件，并幫助吸水。 3：吸附力較強的玻璃纖維，作為金標記物的固相載體。 4：吸收墊，吸水，牽引反應物的運動。5：塑料基板，作為反應體系的支撐物。,金標檢測技術的基本原理,氯金酸(HAuCl4)在還原劑（檸檬酸）作用下，

30、可使金離子還原成金原子，并聚合成一定大小的金顆粒，形成一種膠體溶液。把這種溶液稱為膠體金。 膠體金具有很大的表面積，可將抗原、抗體等蛋白質吸附到膠體金顆粒表面。,吸附的機理是膠體金顆粒表面帶負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固的結合。,,在玻纖上噴抗原標記的金顆粒,,標記抗原的金顆粒,,玻纖,,在纖維素膜上噴AIV抗體,纖維素膜,抗體,,,,以AIV為例,試劑條組裝,被標記的金顆粒,抗體,樣品墊,濾紙,,,,,AIV

31、金標試紙條的工作原理,加入樣品,樣品流動,,,樣品中沒有AIV時：,T線,,金顆粒上的AIV和纖維素膜上的抗體結合，金顆粒聚集在一起，形成紅色的條帶，結果為陰性。,樣品中有高濃度的AIV時：,,由于樣品中AIV的分子數(shù)量很多，大大多于金顆粒上的AIV ，抗體上都結合了樣品中的AIV ，而金顆粒不能結合到抗體上，造成金顆粒穿過抗體條帶到濾紙上，纖維素膜上為白色。,AIV分子,,,T線,樣品中含有少量的AIV時：如0.13HAU,,樣品中A

32、IV分子較少時，和交聯(lián)在金顆粒上的AIV互相競爭，有少量的金顆粒吸附在纖維素膜上，行成顏色較淺的T線。,T線,在醫(yī)學上使用的各種金標試紙條，如艾滋病、乙肝、海洛因等檢測試紙條，要求非常嚴格。纖維素膜上除噴上抗體形成T線（Test）外，還噴有形成C線（Control）的抗體。 C線應在檢測過程中的任何情況下都應該出現(xiàn)，否則就證明試紙條在運輸、保存等過程中發(fā)生了意外情況，如高溫、潮濕等，導致試劑條失效。這樣就有了一個試劑本身

33、質量的判定標準，避免由于試劑保存等原因造成的假陽性或假陰性等情況的出現(xiàn)。,,,,,,,,T線,C線,這樣，在高濃度的情況下，即使T線不出現(xiàn)，只要C 線出現(xiàn)，就知道試劑沒有問題。而如果連C線都沒有，則可知道是試劑有問題，該包裝的試劑應該棄用。這樣就避免了假陽性的結果。,,檢測原理示意圖,膠體金顆粒表面包被有可以識別待測藥物的抗體檢測線包被有藥物-BSA偶聯(lián)物，可以識別膠體金上的抗體質控線包被有可結合膠體金顆粒的抗體,(三)、禽流感金標

34、試劑的使用(深圳真瑞生物科技有限公司),產(chǎn)品可于室溫下陰涼避光干燥處貯存，有效期12個月（無需在冰箱中保存）。 檢測閾值：0.13 HAU檢測不需要其它任何的輔助儀器,使用方法,,,,,,,操作步驟1. 檢測準備,（1） 根據(jù)檢測樣品和標準品的數(shù)量確定需要 的試紙條數(shù)量，并取出；（2）在金標試劑空白處寫上樣品編號。,寫編號,,,2、操作步驟,第一步：在室溫下，將測試卡平放在桌面上；

35、第二步：用試劑包裝中所帶的塑料吸管吸取檢測樣品或其它提取樣品；第三步：在加樣孔中滴五滴樣品，5分鐘內(nèi)判讀結果。,結果判讀,,陽性（－）：T 線和C 線都顯色，表示樣品中AIV濃度高于檢測限。陰性（＋）：T 線無顯色C 線顯色，表示樣品中AIV濃度低于檢測限。無 效 ：未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過程或試紙卡已變質失效。在此情況下，應再次仔細閱讀說明書，并用新的試紙卡重新測試。,,杰出的應用價值,AIV抗原快速檢測卡的設計使得結果

36、清晰易判。優(yōu)化的工藝使得即使弱陽性的樣本也能呈現(xiàn)出清晰的檢測線。AIV抗原檢測卡的諸多特性有助于我們獲得準確的檢測結果、高效的檢測效率和經(jīng)濟的檢測費用。,準確的檢測結果,準確率96.8%如下毒株的檢測都成陽性反應,高效的檢測效率,操作簡單結果易判15分鐘出結果可單份檢測,經(jīng)濟的檢測費用,檢測卡的成本遠低于PCR試劑可單份檢測，試劑利用率100%可現(xiàn)場檢測，不需儀器室溫儲存，不需冷鏈有效期長達18個月可檢測多種樣本：

37、咽喉、泄殖腔拭子或糞便,四、水的細菌學檢查,生活用水的水源常被生活污水或工業(yè)廢水或人與動物的糞便所污染，可能含有不同類型的微生物，有腐生性的和病原性的。腐生性微生物對人無害，而病原性微生物則能引起傳染病的發(fā)生。必須對生活用水及其水源進行嚴格的細菌學檢查。 測定水樣是否合乎飲用標準，通常包括下列兩個項目： ◇細菌總數(shù)測定 ◇大腸菌群的測定,,（一）細菌總數(shù)測定,水中細菌總數(shù)可說明被有機物污染的程度。細菌數(shù)越多

38、，有機物質含量越大。腸道中的絕大多數(shù)腐生性和致病性的細菌，可在營養(yǎng)豐富的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進行生長，出現(xiàn)肉眼可見的菌落。 細菌總數(shù)是指1 ml水樣在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃、24小時培養(yǎng)后，所生長的菌落數(shù)。 我國規(guī)定1 ml自來水中的總菌數(shù)不得超過100個,,1. 水樣采集自來水 將自來水龍頭用火焰燒灼3min滅菌，再擰開水龍頭流水5min，以排除管道內(nèi)積存的死水，隨后用

39、已滅菌的三角瓶接取水樣，以供檢測。池水、河水或湖水 將無菌的帶玻塞的小口瓶浸入距水面10～15cm深的水層中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中裝滿后，蓋好瓶塞，取出后立即進行檢測，或臨時存于冰箱，但不能超過24h。,,2.細菌總數(shù)的測定 1)自來水 2)池塘水、河水或湖水 操作步驟 編號 水樣稀釋 取樣 傾注平板 培養(yǎng) 計數(shù),操作步驟,1）編號： 取無菌培養(yǎng)皿9套，每3

40、套為一組，在每組皿底分別寫上10－1 、 10－2 、10－3 。另取3支無菌空試管排列于試管架上，依次標明10－1 、 10－2 、 10－3 ，并向試管中各加入9ml無菌生理鹽水。,,2）水樣稀釋 取1ml水樣加入到9ml無菌水的試管，振蕩混勻，得稀釋度為10－1； 從10－1管中取水樣1ml加到第二支9ml無菌水的管中，振蕩混勻，得10－2，重復上述操作，直至制成10－3稀釋液。,,3）取樣：用三支1ml無菌吸管分別吸

41、取10-1、10-2和10-3稀釋液各1ml，對號放入編好號的無菌培養(yǎng)皿中。4）傾注平板：盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每皿約15ml，置水平位置迅速旋轉平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出或濺到皿蓋上。5）培養(yǎng)：待培養(yǎng)基凝固后，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。,,6）菌落計數(shù)方法 ①計算相同稀釋度的平均菌落數(shù) 。 ②選擇平均菌落數(shù)在30～300之間稀釋

42、度的平板。當只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，則以該平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，作為該水樣的細菌總數(shù)進行報告。,,③若有兩個稀釋度的平均菌落數(shù)均在30～300之間，則按兩個稀釋度菌落總數(shù)的比值來決定取數(shù)。如比值小于2，應取兩者的平均數(shù)；如比值大于2，則取其中較小的菌落總數(shù)進行報告。 ④若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)進行。,,⑤若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則按稀釋度最低的平均

43、菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)進行報告。 ⑥若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，則以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)進行報告。,,,（二）大腸菌群的測定,若水源被糞便污染，則有可能也被腸道病原菌污染，然而腸道病原菌在水中容易死亡與變異，因此數(shù)量較少，要從中特別是自來水中分離出病原菌常較困難與費時，這樣就要找到一個合適的指示菌，此指示菌要求是大量出現(xiàn)在糞便中的非病原菌，并且和水源病原菌相比是較易檢出的。,,若指

44、示菌在水中不存在或數(shù)量很少，則大多數(shù)情況也保證沒有病原菌。最廣泛應用的指示菌是大腸菌群(coliform group)大腸菌群的定義是：一群好氧和兼性厭氧、革蘭氏陰性、無芽胞的桿狀細菌，并在乳糖培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃，24～48 h培養(yǎng)能產(chǎn)酸產(chǎn)氣。根據(jù)水中大腸菌群的數(shù)目來判斷水源是否被糞便所污染，并間接推測水源受腸道病原菌污染的可能性。,,我國規(guī)定每升自來水中大腸菌群數(shù)不超過3個；若只經(jīng)過加氯消毒即供作生活飲用水的水源水，大腸菌群數(shù)

45、平均每升不得超過1000 個；經(jīng)過凈化處理及加氯消毒后供作生活飲用水的水源水，其大腸菌群數(shù)平均每升不得超過10000 個,,檢查大腸菌群的方法有多管發(fā)酵法與濾膜法兩種。多管發(fā)酵法使用歷史較久，又稱水的標準分析方法，為我國大多數(shù)衛(wèi)生單位與水廠所采用；濾膜法是一種快速的替代方法，而且結果重復性好，又能測定大體積的水樣，目前國內(nèi)已有很多大城市的水廠采用此法。,,多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群的原理 多管發(fā)酵法包括：初發(fā)酵試驗

46、、平板分離和復發(fā)酵試驗三部分。,,1. 水樣采集自來水 將自來水龍頭用火焰燒灼3 min滅菌，再擰開水龍頭流水5 min，以排除管道內(nèi)積存的死水，隨后用已滅菌的三角瓶接取水樣，以供檢測。池水、河水或湖水 將無菌的帶玻塞的小口瓶浸入距水面10～15 cm深的水層中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中裝滿后，蓋好瓶塞，取出后立即進行檢測，或臨時存于冰箱，但不能超過24 h。,,2．初發(fā)酵試驗 液體培養(yǎng)基含有乳糖、蛋白

47、胨和溴甲酚紫。 乳糖起選擇性碳源的作用，大腸菌群可發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸（有機酸），產(chǎn)氣（CO2+H2）。 溴甲酚紫是pH指示劑（堿性條件：紫藍色；酸性條件：黃色，變色點pH=6.7）。 將水樣接種在具倒置杜漢氏小管的發(fā)酵管內(nèi)，于37℃下培養(yǎng)，24h后杜漢氏小管的頂端出現(xiàn)氣泡，表明有氣體產(chǎn)生，培養(yǎng)基混濁，顏色變黃，說明水中存在大腸菌群，視為陽性結果。,,用細口瓶取池塘水、河水或湖水的水樣（1）將1 ml 原水樣直接加入

48、10 ml 單倍乳糖培養(yǎng)基試管1支。（2）用蒸餾水稀釋原水樣成10-1 ，取1 ml 直接加入10 ml 單倍乳糖培養(yǎng)基試管1支。 （3）將10 ml 原水樣直接加入含5 ml 3倍乳糖培養(yǎng)基大試管1支。（4）將100 ml 原水樣直接加入含50 ml 3倍乳糖培養(yǎng)基三角瓶1個。,,如有下列情況的出現(xiàn)，其結果判斷需謹慎（1）個別其他類型的細菌在上述條件下也可能產(chǎn)氣，需進行下述試驗（即平板分離和復發(fā)酵試驗）才能進一步確證。 （

49、2）培養(yǎng)24h后產(chǎn)酸，但未見產(chǎn)氣者，不能立即判斷為陰性結果，由于菌量少，也可能延遲至48h后才產(chǎn)氣，應視為可疑結果，也需進行下述試驗（即平板分離和復發(fā)酵試驗）進一步確證，48h后仍不產(chǎn)氣，可判斷為陰性結果。,,3．平板分離 平板分離用培養(yǎng)基通常為：伊紅美藍瓊脂（eosin methylene blue agar， EMB agar），復紅亞硫酸鈉瓊脂（亦稱遠藤氏培養(yǎng)基Endo’s medium）。,,（1）伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基中

50、含有伊紅與美藍這兩種苯胺類染料，它們不但可以抑制G+菌和一些難培養(yǎng)的G-菌，而且在低酸度時，兩種染料結合形成沉淀，起著產(chǎn)酸指示劑的作用。大腸菌群因其強烈發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生大量的混合酸，使菌體表面帶上正電荷，可染上伊紅染料，伊紅與美藍結合，菌體被著上深紫色，在含有兩種染料呈紫色的培養(yǎng)基上，形成帶核心、具金屬光澤的菌落。,,①深紫黑色、有金屬光澤。②紫黑色、不帶或略帶金屬光澤。③淡紫紅色、中心顏色較深。在伊紅美藍這種鑒別性培養(yǎng)基上，大腸

51、菌群呈現(xiàn)特征性菌落，因此，凡是出現(xiàn)這種菌落可確認為是大腸菌群。,,24h和48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的初發(fā)酵菌落均需在上述培養(yǎng)基中的一種，進行平板劃線，分離出陽性菌落。 4．復發(fā)酵試驗 陽性菌落經(jīng)涂片染色鑒別為G-，無芽孢者，再經(jīng)過乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基進行復發(fā)酵試驗，經(jīng)24h培養(yǎng)產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，可確認為大腸菌群陽性結果。,,,,,5.結果： 凡是在乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，在指示性培養(yǎng)基上能生長的，革蘭氏染色為陰性的無芽孢

52、桿菌，在復發(fā)酵管中產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的，即說明有大腸菌群的細菌存在—大腸菌群陽性；有一項不符的，即說明無大腸菌群的細菌存在—大腸菌群陰性。根據(jù)有大腸桿菌細菌存在的初發(fā)酵管的管數(shù)，查相應的大腸桿菌檢索表，報告每100毫升待檢樣品中大腸菌群細菌的最近似數(shù)。,大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表,大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表,,,參考文件：細菌的革蘭氏染色法.ppt藥敏試驗(擴散法)操作方法.ppt金標快速檢測試劑卡檢測技術.ppt現(xiàn)代免