細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題

1、1細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題基礎(chǔ)篇基礎(chǔ)篇無菌操作基本技術(shù)無菌操作基本技術(shù)?1.1.實驗進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺實驗進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(laminar(laminarflow)flow)以紫外燈照射以紫外燈照射30306060分鐘滅菌，以分鐘滅菌，以7070%ethanol%ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)扇運轉(zhuǎn)1010分鐘后，才開始實驗操作。分鐘后，才開

2、始實驗操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實驗完，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以畢后，將實驗物品帶出工作臺，以7070%ethanolethanol擦拭無菌操作抬面。操擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)1010分鐘以上后，再進(jìn)行下一個細(xì)胞株之操分鐘以上后，再進(jìn)

3、行下一個細(xì)胞株之操作。作。?2.2.無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實驗用品以氣流之流通。實驗用品以7070%ethanolethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在抬面之中央無

4、菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。驗操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。?3.3.小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約瓶蓋并握住瓶身，傾斜約4545角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌角取用，盡

5、量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。面。?4.4.工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進(jìn)行實驗。對工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進(jìn)行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷趤碜匀祟惢蚴遣《靖腥局?xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺無菌操作臺(至少至少ClassClassII)II)。操作過程中，應(yīng)避免引起。操作過程中，應(yīng)避免引起aerosolaerosol之產(chǎn)之產(chǎn)生，小心

6、毒性藥品，例如生，小心毒性藥品，例如DMSODMSO及TPATPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。等，并避免尖銳針頭之傷害等。?5.5.定期檢測下列項目：定期檢測下列項目：5.1.5.1.CO2CO2鋼瓶之鋼瓶之CO2CO2壓力壓力5.2.5.2.CO2CO2培養(yǎng)箱之培養(yǎng)箱之CO2CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水盤的水用無菌水，每周更換水，每周更換)。5.3.5.3.無菌操作臺內(nèi)之無菌操作臺內(nèi)

7、之a(chǎn)irflowairflow壓力，定期更換紫外線燈管及壓力，定期更換紫外線燈管及HEPAHEPA過濾過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)膜，預(yù)濾網(wǎng)(300(300小時小時預(yù)濾網(wǎng)，預(yù)濾網(wǎng)，30003000小時小時HEPA)HEPA)。?6.6.水槽可添加消毒劑水槽可添加消毒劑(Zephrin(Zephrin1:750)1:750)，定期更換水槽的水。，定期更換水槽的水?；A(chǔ)篇基礎(chǔ)篇實驗用品實驗用品?1.1.種類︰種類︰1.1.1.1.細(xì)胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌

8、，除了玻璃容器與細(xì)胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteurpasteurpipetpipet外，外，其它均為塑料無菌制品。其它均為塑料無菌制品。1.2.1.2.TCTC級培養(yǎng)盤表面均有級培養(yǎng)盤表面均有coatingcoating高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類有種類有TflaskTflask，platesplatesdishesdishesrollerrollerbottlebottle等

9、，依實驗需要使用。等，依實驗需要使用。1.3.1.3.plasticplasticsterilesterilepipet:pipet:1mlml2ml5ml5mlml1010mlml2525mlml1.4.1.4.塑料離心管塑料離心管:1515mlml5050mlml，均有，均有2種不同材質(zhì)，其中種不同材質(zhì)，其中polypropylenepolypropylene(PP)(PP)為不透明材質(zhì)，為不透明材質(zhì)，polystyrenepoly

10、styrene(PS)(PS)為透明材質(zhì)，可為透明材質(zhì)，可依實驗需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。依實驗需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。1.5.1.5.glassglasspastuerpastuerpipet:pipet:9inchinch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。1.6.1.6.玻璃血清瓶玻璃血清瓶(Pyrex(PyrexDuranDuranglassware)glassware)：100100mlml250250ml5

11、00ml500ml1000mlml1000ml3MDCKMDCKcellcell(ATCC(ATCCCCL34CCL34或CCRCCCRC60004)60004)6well6wellTCTCplateplate((3535mmmmTCTCdish)dish)methanolmethanolglacialglacialaceticaceticacidacid1010%GiemsaGiemsasolutionsolution(GibcoBR

12、L(GibcoBRL10092013)10092013)?步驟：步驟：1.1.以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCKMDCKcellcell，接種，接種MDCKMDCK細(xì)胞于細(xì)胞于6well6wellplateplate(或35mm35mmTCTCdish)dish)中，每個中，每個wellwell接種接種110102活細(xì)胞，同時作對照組實驗。活細(xì)胞，同時作對照組實驗。2.2.接種接種5～7天后，在天后，在100100倍倒立顯微鏡

13、作觀察細(xì)胞群落之生長，待細(xì)倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。3.3.去除培養(yǎng)基，加入去除培養(yǎng)基，加入1mlmlCarnoy’sCarnoy’s固定液固定液(甲醇：冰醋酸﹦甲醇：冰醋酸﹦3:1)3:1)，室，室溫下靜置溫下靜置1010minmin。4.4.去除固定液，水洗二次。去除固定液，水洗二次。5.5.加入加入1mlml1010%G

14、iemsaGiemsasolutionsolution，，室溫下靜置染色，，室溫下靜置染色2323minmin。6.6.去除染液，水洗二次。去除染液，水洗二次。7.7.以肉眼計數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細(xì)胞生以肉眼計數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細(xì)胞生長不佳，則丟棄之。長不佳，則丟棄之。基礎(chǔ)篇基礎(chǔ)篇抗生素抗生素?1.1.細(xì)胞庫之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素細(xì)胞庫之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素1.1.1.1.培養(yǎng)自培養(yǎng)

15、自ATCCATCC引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。1.2.1.2.培養(yǎng)自其它實驗室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作培養(yǎng)自其它實驗室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作tokentokenfreezefreeze前培養(yǎng)基須添前培養(yǎng)基須添加抗生素，待加抗生素，待tokentokenfreezefreeze通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素。素。?2.2.寄送活細(xì)胞時，須將培養(yǎng)液充滿整個寄送活細(xì)胞時

16、，須將培養(yǎng)液充滿整個flaskflask時，則須添加抗生素時，則須添加抗生素(penicillin(penicillin100100unitsmlunitsmlstreptomycinstreptomycin100100ugml)ugml)。?3.3.若要檢測若要檢測mycoplasmamycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicingentamicin，因，因gentamicingentamicin會抑

17、制會抑制mycoplasmamycoplasma生長。生長。?4.4.去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方:penicillinpenicillin250250unitsmlunitsmlstreptomycinstreptomycin250250ugmlugmlneomycinneomycin250250ugmlugmlbacitracinbacitracin2.52.5unitsmlunitsml，注意混合使用后

18、藥物毒性會增強。，注意混合使用后藥物毒性會增強。?5.5.抗生素使用種類與濃度：抗生素使用種類與濃度：工作濃度工作濃度.儲存溫度儲存溫度.殺滅細(xì)菌殺滅細(xì)菌penicillinpenicillin100100unitsmlunitsml2020℃G()G()bacteriabacteriastreptomycinstreptomycin100100ugmlugml2020℃G()G()G()G()bacteriabacteriachlot