western blot顯色篇

1、WesternBlot顯色篇WB蛋白印跡在生物化學(xué)這一塊是常規(guī)實(shí)驗(yàn)，就像有人說炒菜中境界最高也最難的是蛋炒飯一樣，實(shí)驗(yàn)中常規(guī)實(shí)驗(yàn)也是很考驗(yàn)技能的，除了潛心研究原理、認(rèn)真揣摩技巧以外，對于新實(shí)驗(yàn)試劑的信息把握，勇于嘗試新方法也是非常之重要的——各大廠家都在不斷開發(fā)更方便更靈敏的新產(chǎn)品，“idea是生產(chǎn)力”嘛，因此生物通這里介紹一些能把我們從日常操作中解脫出來，獲得“升級版”效果WB產(chǎn)品。講完了WesternBlotting的電泳轉(zhuǎn)移儀器，

2、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和轉(zhuǎn)移膜之后，我們最后來探討一下WB的檢測系統(tǒng)。一般的WB檢測過程中，都會有封閉、一抗、二抗和底物顯色這四道工序要“加工”。我個人覺得底物顯色這最后一步是最關(guān)鍵的，也是最有文章可以作的一個部分。你看，光標(biāo)記方式就有生物素標(biāo)記，地高辛標(biāo)記，各種酶標(biāo)記等等，酶標(biāo)的底物又有各種生色底物、化學(xué)發(fā)光法底物和熒光底物可供選擇；就連識別一抗的配體也不一定非要二抗不可，也可以是抗生物素蛋白，鏈親和素或者ProteinA或G等，更別說各種試

3、劑盒琳瑯滿目，叫人好像無從下手！不過不急，生物通幫你作個參考，讓你對各種產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)一覽無遺，真正成為一個WB高手。另外如果實(shí)驗(yàn)室有已經(jīng)建立的固定的顯色方法，那也沒關(guān)系，有時候不經(jīng)意瀏覽到的方法可能就會對你的實(shí)驗(yàn)有莫大的幫助——這也就達(dá)到我們的目的了。與蛋白質(zhì)組學(xué)一線專家面對面，趕快報(bào)名參加第二期蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與應(yīng)用高級培訓(xùn)班！封閉和一抗的選擇沒有太多的選擇余地——封閉前面介紹過了；一抗？現(xiàn)在的抗體產(chǎn)品說明書一般都有注明應(yīng)用范圍的，說

4、明可以用于WB的就OK。如果沒有這些信息可以遵從以下原則：單抗專一性高，但是經(jīng)過SDSPAGE變性膠電泳的蛋白質(zhì)可能由于原來的識別位點(diǎn)構(gòu)象發(fā)生改變而不被識別，多抗不如單抗專一性高但更容易得到結(jié)果。如果還有多種抗體選擇，那當(dāng)然是來源于兔或者小鼠抗體為好，因?yàn)楹罄^的檢測試劑盒一般都是針對兔鼠的居多，因而選擇范圍更大通用性也更強(qiáng)。除了無標(biāo)記的一抗，還有生物素等各種標(biāo)記一抗。還聽說有用熒光標(biāo)記的一抗直接檢測而降低背景和非特異結(jié)合，不過由于少了二

5、抗的級聯(lián)放大信號擴(kuò)增，信號也會比較弱，所以需要選擇熒光信號特別明亮的標(biāo)記（Invitrogen收購了著名的MolecularProbes后有推出AlexaFlu的抗體標(biāo)記試劑盒，生物通這里有詳細(xì)而精彩的介紹，我們就不羅嗦了。畢竟不是WB的主流方法。）一抗的稀diaminobenzidinetetrahydrochlideethylcarbazoltetramethylbenzidine分子量214.14178.58210.28240.4

6、穩(wěn)定性好一般避光好靈敏度250pg1ng100pg背景一般低高高終產(chǎn)物成像性不能很好的成像容易成像容易成像顏色褐色介于藍(lán)色與藍(lán)紫色之間（可用于doublestaining）棕紅色藍(lán)紫色毒性有（疑有治癌作用）無有無最熟悉的底物應(yīng)該是33二氨基聯(lián)苯胺DAB，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性產(chǎn)物，靈敏度高，特異性好，缺點(diǎn)就是需要現(xiàn)配現(xiàn)用，顯色后光照數(shù)小時會褪色，不能永久保存，需要拍照記錄，而且有毒。DAB的選擇有一點(diǎn)小小的技巧——33二氨

7、基聯(lián)苯胺4鹽酸鹽的純品分子量為360.1，通常是深棕色粉末，不太好溶于水，容易得到有色顆粒的溶液而導(dǎo)致膜上的背景，而且價格還被炒得貴；但是如果選擇2水合33二氨基聯(lián)苯胺4鹽酸鹽（分子量396.14）就是白色粉末狀晶體，易溶，溶液無色均勻，量大價格還便宜。DAB還有溶劑形式的，便于使用。由于DAB顯色是褐色，不如4CN反差大容易拍照，有的廠家還推出了DAB4CN混合底物，結(jié)合了DAB靈敏度高和4CN背景低，易成像的優(yōu)點(diǎn)，能獲得很好的黑色沉