組培過(guò)程中的玻璃化問(wèn)題

1、組培過(guò)程中的玻璃化問(wèn)題組培過(guò)程中的玻璃化問(wèn)題在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)試管苗生長(zhǎng)異常，表現(xiàn)為試管苗葉、嫩梢呈水晶透明或半透時(shí)，水浸狀；整株矮小腫脹、失綠；葉片皺縮成縱向卷曲、脆弱易碎；葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒(méi)有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織。這種試管苗生長(zhǎng)異常現(xiàn)象就是P.Debergh（1981）首先命名的“玻璃化”（Vitrification）。是植物組織培養(yǎng)過(guò)程中所特有的一種生理失調(diào)或生理病變。玻璃苗中因其體內(nèi)含水量高

2、，干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和森質(zhì)素含量低、角質(zhì)層、柵欄組織等發(fā)育不全，表現(xiàn)為光合能力和酶活性降低，組織畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很難繼續(xù)用作繼代培養(yǎng)和擴(kuò)大繁殖的材；生根困難，移栽后也很難成活。植物微體快速繁殖時(shí)玻璃苗的出現(xiàn)已成為一種很普遍的現(xiàn)象，該苗有時(shí)多達(dá)50%以上，嚴(yán)重影響繁殖率的提高，已成為莖尖脫毒、工廠化育苗和材料保存等方面的嚴(yán)重障礙，造成人、財(cái)、物的極大浪費(fèi)，所以試管苗下班化現(xiàn)象對(duì)植物組織培養(yǎng)的危害是相當(dāng)嚴(yán)重

3、的，也是亟待解決的問(wèn)題。（一）玻璃苗發(fā)生的因素瓊脂和蔗糖濃度與玻璃化成負(fù)相關(guān)，瓊脂或蔗糖濃度越高，玻璃苗的比率越低。DanielG.W.Brown認(rèn)為玻璃化可能是培養(yǎng)基滲透勢(shì)不當(dāng)所致。碳源不僅為芽的形成提供能量，而且也起滲透調(diào)節(jié)作用，主要影響培養(yǎng)基的滲勢(shì)（Salisbury等）。隨瓊脂濃度及純度的增加，培養(yǎng)基硬度增加，從而影響其襯質(zhì)勢(shì)和水分狀況。Debergh等研究表明，液體培養(yǎng)基的水勢(shì)影響玻璃苗的形成，Ziv等認(rèn)為只要降低培養(yǎng)容器中的

4、相對(duì)濕度，就可以降低玻璃苗的比例。劉思穎等（1988）測(cè)得絲石竹玻璃苗葉片的水勢(shì)約為正常苗的1.9倍，含水量為正常苗的2.09倍—2.21倍。自由水和高濕度可能與肉質(zhì)嫩梢的形成有關(guān)。Davis等研究表明，液體培養(yǎng)是導(dǎo)致玻璃化的主要原因。可以斷定，試管苗玻璃化可能是培養(yǎng)基內(nèi)水分狀態(tài)不適應(yīng)的一種生理變態(tài)。許多學(xué)者證明培養(yǎng)基中BA濃度和培養(yǎng)溫度與玻璃化成正相關(guān)，BA濃度越高或培養(yǎng)溫度越高，玻璃苗比率越大。Debergh曾用14CKT研究表明，

5、隨瓊脂濃度的增加，KT利用率降低。同時(shí)也證明，隨BA濃度的增加，玻璃化率增加。Bnman等用14CBA研究表明，14CBA的積累與不定芽分化和玻璃化是同步的。玻璃化苗的一個(gè)重要特征是葉脈明顯加長(zhǎng)，而GA3也有類(lèi)似效應(yīng)，也許GA3促進(jìn)了細(xì)胞過(guò)度生工，從而導(dǎo)致玻璃化。生長(zhǎng)素可以改變細(xì)胞壁的機(jī)械特性，使其具有更大的可塑性。許多研究表明，非受傷的物理和化學(xué)協(xié)迫可以增加乙烯的合成。玻璃化被認(rèn)為是一種非受傷協(xié)迫條件下形態(tài)上的反應(yīng)。玻璃苗苯丙氨酸解氨

6、酶（PAL）的活性低于正常植株。在協(xié)迫條件下乙烯的快速合成，又通過(guò)抑制氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）酶的形成，對(duì)乙烯起反饋調(diào)節(jié)作用。通過(guò)改善氣體交換防止玻璃化形成，可能與克服乙烯反饋抑制有關(guān)。一種與膜有關(guān)的過(guò)氧化物酶直接或間接摻入ACC合成乙烯?，F(xiàn)已證明，IAA氧化酶體系至少在乙烯合成的最后一步起作用。IAA含量降低將進(jìn)一步通過(guò)IAA調(diào)節(jié)S腺苷甲硫氨酸（SAM）轉(zhuǎn)化成ACC這一過(guò)程，從而降低了乙烯形成。Kevers等曾證明，對(duì)于玻璃苗，堿性過(guò)

7、氧化酶同功酶活性增加，而酸性同功酶活性降低。但總可溶性過(guò)氧化物酶活性增加，僅限于堿性提取物。有人認(rèn)為，玻璃化的形成主要是膜的效應(yīng)而與核酸無(wú)關(guān)。乙烯促進(jìn)了葉綠素分解及細(xì)胞的畸形發(fā)展。乙烯處理破壞了膜的結(jié)構(gòu)，隨著細(xì)胞壁解離，細(xì)胞內(nèi)積累有在量纖維素及泡狀物質(zhì)?？梢?jiàn)，乙烯對(duì)玻璃化的影響，與改變組織的生理生化及纖維結(jié)構(gòu)有關(guān)。HakkartF.A.等認(rèn)為玻璃苗是培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)氣體與外界交換不暢造成的。密閉的封瓶口材料是導(dǎo)致玻璃化的原因之一（陳國(guó)菊等199

8、2，李云等1996）。培養(yǎng)基中高的含N量，特別是高的氨態(tài)N，也是導(dǎo)致玻璃化的因素。有人發(fā)現(xiàn)不同部位的節(jié)段外植體與玻璃化有關(guān)，以留蘭香基部節(jié)段所形成的試管苗玻璃苗嚴(yán)重，中部莖段次之，莖尖最好（柴明良）；重瓣絲石竹中部莖段出現(xiàn)玻璃苗較多，基部莖段較少，莖尖沒(méi)有（郭達(dá)初）。郭東紅等（1989）認(rèn)為瑞香莖尖外植體大小與玻璃化相關(guān)，莖尖外植體越小，出現(xiàn)玻璃苗比率越大。（二）玻璃苗發(fā)生的機(jī)理Kevers等的試驗(yàn)表明，蘋(píng)果砧木M7等的玻璃苗是由于過(guò)氧

9、化物酶——吲哚乙酸氧化酶系統(tǒng)控制的乙烯過(guò)飽和的影響，并認(rèn)為細(xì)胞激動(dòng)素和NH4離子的過(guò)剩是一種最初的脅迫，受脅迫的試管苗在乙烯過(guò)剩的空氣中，抑制了乙烯的生物合成，結(jié)果降低苯丙氨酸解氨酶（PAL）和酸性過(guò)氧化物酶的活性，從而妨礙組織木質(zhì)化，導(dǎo)致形成玻璃苗。一種誘導(dǎo)協(xié)迫（過(guò)多的細(xì)胞分裂素和NH4），可以通過(guò)酚含量的快速化調(diào)節(jié)不斷增加的過(guò)氧化物酶活性。乙烯的大量形成又對(duì)其自身起反饋抑制作用，結(jié)果PAL和酸性過(guò)氧化物酶活性降低，從而抑制木質(zhì)化過(guò)程

10、的進(jìn)行。糖用于氨基酸的合成，纖維素含量降低。由于缺乏纖維素和木質(zhì)素，壁壓降低，從而細(xì)胞過(guò)分吸水，并導(dǎo)致玻璃化。張洪勝等認(rèn)為在試管苗玻璃化過(guò)程中，作為內(nèi)源激素的乙烯從代謝調(diào)節(jié)上起了關(guān)鍵性啟動(dòng)作用。而乙烯的產(chǎn)生則取決于培養(yǎng)環(huán)境中的脅迫條件，如水勢(shì)不當(dāng)，通氣不暢（造成缺氧）及培養(yǎng)基用BA量過(guò)高等，均會(huì)導(dǎo)致乙烯產(chǎn)生。乙烯產(chǎn)生后引發(fā)了其他激素質(zhì)和量上的改變及酶類(lèi)的變化。因此，發(fā)生蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素的合成障礙及降解，葉綠素分解黃化，逐漸形成玻璃

11、化癥狀；張昆瑜等（1991）認(rèn)為乙烯克服試管苗玻璃化的機(jī)理是復(fù)雜的，在添加乙烯前體ACC（1氨基環(huán)丙烷1羧酸）和乙烯釋放劑CEPA（乙烯利）的培養(yǎng)基上許多植物的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)有褐變現(xiàn)象，尤以木本植物組織培養(yǎng)中褐變嚴(yán)重。褐變主要發(fā)生在外植體、愈傷組織的繼代、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)等。褐變產(chǎn)物不僅使外植體、細(xì)胞、培養(yǎng)基等變褐，而且對(duì)許多酶有抑制作用，從而影響培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)與分化，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡。[1]褐變的機(jī)理正常細(xì)胞內(nèi)，區(qū)

12、域性分布使底物與PPO不能接觸并不發(fā)生褐變，當(dāng)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和破壞時(shí)，酶和底物就結(jié)合在一塊，在氧的作用下，生成醌，從而引起褐變。引起褐變的條件：氧、引起褐變的酶、底物，缺一不可。引起褐變的酶：多酚氧化酶（PPO是主要的）、過(guò)氧化物酶（POD）、、苯丙氨酸解氨酶等。引起褐變的酶的底物：主要是酚類(lèi)化合物，可分成3類(lèi)：第一類(lèi)是苯基羧酸，包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒(méi)食子酸、莽草酸等；第二類(lèi)是苯丙烷衍生物，包括肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木

13、質(zhì)素等；第三類(lèi)是黃烷衍生物，包括花青素、黃酮、蕓香苷等。[2]影響褐變的因素因子是復(fù)雜的，隨植物的種類(lèi)、基因型、外植體部位及生理狀態(tài)等的不同，褐變的程度也有所不同。A.植物種類(lèi)及基因型紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)過(guò)程中，常常發(fā)生培養(yǎng)細(xì)胞褐變現(xiàn)象，輕者影響細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，重者導(dǎo)致細(xì)胞死亡。豆科植物和蕓苔屬植物原生質(zhì)體培養(yǎng)中容易褐化也是一個(gè)普遍的問(wèn)題，橡膠的花藥培養(yǎng)中，海墾2號(hào)花藥的褐變較少，因而愈傷組織的誘導(dǎo)容易；而有些品系花藥容易褐變

14、，因而愈傷組織的誘導(dǎo)困難。在組織培養(yǎng)中，有些品種、品系難以成功，而有些則容易成功。油菜葉原生質(zhì)體品種373褐化比品種94591、95386嚴(yán)重B.外植體部位及生理狀態(tài)荔枝莖的愈傷組織中度褐變，而根的愈傷組織全部褐變。歐洲栗幼年型的材料培養(yǎng)時(shí)含醌類(lèi)物質(zhì)少，成年型材料培養(yǎng)時(shí)含醌類(lèi)物質(zhì)多，后者比前者褐變嚴(yán)重。油棕幼嫩外植體（如胚）培養(yǎng)較少褐變，高度分化的葉片接種后則容易褐變。C.培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件硬紫草從長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)且次生代謝物含量高引起培

15、養(yǎng)物的褐變。用B5培養(yǎng)基可有效地防止褐變。茼蒿用甘露醇或蔗糖作為滲透壓調(diào)節(jié)劑易發(fā)生褐變，不能或只能形成少量細(xì)胞團(tuán)用葡萄糖作滲透壓調(diào)節(jié)劑褐變較少，效果好。柿樹(shù)ZT9.13μmolL、IAA0.57μmolL減輕褐變程度。BA或KT提高了褐變甘蔗組織培養(yǎng)中易產(chǎn)生褐變。荔枝培養(yǎng)基添加1mgL6BA0.5mgL24D時(shí)，愈傷組織較硬、增殖緩慢、易褐變；培養(yǎng)基添加1mgL6BA1mgL24D時(shí)，愈傷組織淺黃疏松、增殖快[4]。D.pH值影響材料的

16、褐變大白菜pH值至6.5，很大程度上可抑制褐變。水稻pH值為4.5～5.0時(shí)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的，其表面呈黃白色，pH值為5.5～6.0時(shí)，愈傷組織嚴(yán)重褐變。E.培養(yǎng)條件不適宜溫度過(guò)高或光照過(guò)強(qiáng)，均可使PPO的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的組織褐變。高濃度CO2也會(huì)促進(jìn)褐變，其原因是環(huán)境中的CO2向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，使細(xì)胞內(nèi)CO32增多，產(chǎn)生褐變。[3]克服褐變的方法a.選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w成年植株比實(shí)生幼苗褐變的程度嚴(yán)重，夏季材料比冬季及早春和秋季的材