玻璃化冷凍技術(shù)在卵巢自體移植中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：①比較不同玻璃化冷凍方案對(duì)小鼠卵巢組織的影響，為人類卵巢組織玻璃化冷凍方案的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。②觀察不同的蔗糖濃度對(duì)玻璃化凍存小鼠卵巢組織的影響。③研究Caspase抑制劑z-DEVD-fmk對(duì)玻璃化凍融小鼠卵巢組織的影響。④通過檢測(cè)卵泡顆粒細(xì)胞凍融后Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3表達(dá)的變化，來揭示卵泡顆粒細(xì)胞在凍融過程中其Caspase激活的途徑。 方法：⑴將80只小鼠的卵巢進(jìn)行玻璃

2、化冷凍，根據(jù)不同的冷凍保護(hù)劑組合[I:200/0(v/v) EG+20％(v/v) DMSO，II:20％(v/v)EG+20％(v/v)PROH，III:20％(v/v) PROH+20％(v/v)DMSO]和平衡時(shí)間(a:15分鐘，b：30分鐘，c：45分鐘)，將實(shí)驗(yàn)組的小鼠隨機(jī)分為9組，新鮮的和凍融后的卵巢皮質(zhì)分別進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察、TUNEL實(shí)驗(yàn)和免疫組織化學(xué)分析。⑵60只小鼠被隨機(jī)分為新鮮對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行玻璃化凍融。

3、根據(jù)不同的蔗糖濃度，實(shí)驗(yàn)組分為I組(0.2 M蔗糖)、II組(0.4 M蔗糖)、III組(0.8 M蔗糖)和Ⅳ組(1.6 M蔗糖)。移植術(shù)后進(jìn)行陰道細(xì)胞涂片檢查，移植術(shù)后1個(gè)月測(cè)血清雌二醇和卵巢移植物卵泡密度。⑶將30只小鼠隨機(jī)分為三組：A組(新鮮對(duì)照組)、B組(添加z-DEVD-fmk組)和C組(未添加z-DEVD-fmk組)，B組和C組的卵巢組織進(jìn)行玻璃化冷凍，一部分卵巢皮質(zhì)組織進(jìn)行組織學(xué)分析，另一部分卵巢皮質(zhì)組織進(jìn)行自體移植，手術(shù)

4、后一個(gè)月后測(cè)血清雌二醇濃度和卵巢移植物的增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)率。⑷將小鼠分為新鮮對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行玻璃化凍-融。新鮮對(duì)照組分為A組(顆粒細(xì)胞來自新鮮的卵巢組織)和C組(新鮮卵巢組織的顆粒細(xì)胞、體外培養(yǎng)2小時(shí))。實(shí)驗(yàn)組分為B組(顆粒細(xì)胞來自凍融后卵巢組織)和D組(凍融后的組織的顆粒細(xì)胞、體外培養(yǎng)2小時(shí))。應(yīng)用RT-PCR和Western-blot檢測(cè)卵泡顆粒細(xì)胞Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)情況。

5、 結(jié)果：㈠光鏡觀察發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組的始基卵泡形態(tài)正常率和竇前卵泡形態(tài)正常率均明顯低于對(duì)照組，IIb組的始基卵泡形態(tài)正常率和竇前卵泡形態(tài)正常率均高于其它實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IIb組卵泡凋亡率和Bax蛋白陽性表達(dá)率低于其它實(shí)驗(yàn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)II組(0.4M蔗糖)和III組(0.8M蔗糖)的小鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期的天數(shù)少于I組(0.2M蔗糖)和IV組(1.2M蔗糖)的小鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期的天數(shù)，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而II組

6、(0.4M蔗糖)和III組(0.8M蔗糖)之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，II組(0.4M蔗糖)和III組(0.8M蔗糖)的小鼠血清雌二醇濃度和卵巢移植物的卵泡密度高于I組(0.2M蔗糖)和IV組(1.2M蔗糖)的小鼠血清雌二醇濃度和移植物的卵泡密度，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而II組(0.4M蔗糖)和III組(0.8M蔗糖)之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③光鏡觀察發(fā)現(xiàn)冷凍組的始基卵泡和竇前卵泡的形態(tài)正常率均明顯低于對(duì)照組，B組的始基卵泡和竇前卵泡的

7、形態(tài)正常率與C組比較無明顯差異。然而，B組血清雌二醇濃度高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C組竇前卵泡的超微結(jié)構(gòu)改變較B組的改變明顯，同樣，B組移植物卵細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)率高于C組。④與新鮮的顆粒細(xì)胞相比，凍融后的顆粒細(xì)胞的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表達(dá)顯著上升，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果還顯示：體外培養(yǎng)2小時(shí)后的凍融的卵巢顆粒細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表達(dá)水平

8、均較未培養(yǎng)的凍融后卵巢顆粒細(xì)胞的高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：⑴IIb方案(EG與PROH的組合，室溫下平衡時(shí)間30分鐘)是適合于小鼠卵巢組織(皮質(zhì)切片，體積1 mm3)的玻璃化冷凍方案。⑵0.4M或0.8M是適合于玻璃化凍存小鼠卵巢組織的蔗糖濃度。⑶Caspase抑制劑z-DEVD-fmk在卵巢組織凍融過程中具有保護(hù)作用。⑷卵巢顆粒細(xì)胞凋亡是卵巢顆粒細(xì)胞凍-融損傷的重要機(jī)制，線粒體通路和死亡受體通路同時(shí)參與了對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞