組氨酸殘基的化學(xué)修飾對(duì)酪氨酸酶活性和構(gòu)象的影響.pdf

1、酪氨酸酶(EC1.14.18.1)是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶。酪氨酸酶廣泛分布于生物有機(jī)體中，在黑色素合成代謝途徑中具有多種催化功能。該酶的生物學(xué)活性中心有一個(gè)雙銅活性部位，每個(gè)銅離子以一價(jià)或二價(jià)分別與3個(gè)組氨酸結(jié)合，它們通過(guò)氧化態(tài)(Eoxy)、脫氧態(tài)(Edeoxy)和還原態(tài)(Emet)直接參與不同的催化反應(yīng)。由于酪氨酸酶具有多種催化功能，其催化機(jī)理非常復(fù)雜，不同來(lái)源的酪氨酸酶表現(xiàn)出不同的催化反應(yīng)機(jī)制，需要通過(guò)不同的動(dòng)力學(xué)方法來(lái)研究。酪

2、氨酸酶的晶體結(jié)構(gòu)至今仍未闡明，鑒于該酶在實(shí)際應(yīng)用中的廣泛性，因此深入研究酶作用的催化機(jī)制，以及酶的活性中心意義重大。 本文根據(jù)蘑菇酪氨酸酶的基因序列(GenBank，AJ223816)，存在非共價(jià)結(jié)合的游離組氨酸和半胱氨酸殘基，使得添加化學(xué)試劑形成配體結(jié)合形式具有可能。當(dāng)?shù)孜?L-酪氨酸或L-多巴)與酶活性中心結(jié)合時(shí)，這些殘基在某種程度上將參與催化反應(yīng)。因此，在本研究中為闡明位于酪氨酸酶活性中心的游離組氨酸殘基的作用，用溴乙酸(

3、BrAc)作修飾劑，發(fā)現(xiàn)溴乙酸修飾后的組氨酸殘基可顯著降低酶的活性。進(jìn)一步以BrAc為修飾劑研究其抑制動(dòng)力學(xué)，并通過(guò)熒光檢測(cè)手段了解修飾后的酶的構(gòu)象變化。結(jié)果表明，組氨酸被BrAc修飾不僅顯著的抑制酪氨酸酶，而且使其構(gòu)象發(fā)生改變。Br離子的結(jié)合直接誘導(dǎo)了酪氨酸酶疏水表面的暴露并引起酶活性的降低，可能暗示該酶活性位點(diǎn)具有柔性。本文利用酶促反應(yīng)抑制動(dòng)力學(xué)的方法和熒光檢測(cè)手段，提示酪氨酸酶活性位點(diǎn)具有柔性的特征，并發(fā)現(xiàn)游離組氨酸殘基可能參與了