基于蛋白質(zhì)和dna的食品過敏原檢測技術(shù)的研究進展

1、中國釀造2017年第36卷第7期總第305期食品過敏是致敏機體在再次受到食品中同種抗原刺激時引起的不良免疫反應(yīng)。食品過敏反應(yīng)通常由免疫球蛋白E（immunoglobulinE，IgE）介導(dǎo)，主要分為致敏和發(fā)敏兩階段。在機體初次受食品中抗原刺激后會產(chǎn)生抗原特異性IgE，并與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的Fc受體結(jié)合，使機體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)機體再次接觸同一食品抗原后，會在肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面通過交聯(lián)抗原特異性IgE產(chǎn)生過敏反應(yīng)，使得大量

2、蛋白水解酶、白三烯或促炎細胞因子釋放，引起過敏癥狀。致敏個體由于過敏原的攝入而產(chǎn)生的臨床癥狀包括蕁麻疹、瘙癢、水腫、支氣管痙攣、鼻炎、嘔吐、腹瀉、痙攣，甚至致命的過敏性休克[12]。目前，食品過敏被世界衛(wèi)生組織納入五個最重要的公共健康問題之一，特別是在工業(yè)國家，有2%成年人和4%～8%幼兒受其影響。由于不同地區(qū)飲食習(xí)慣的不同，食品過敏的發(fā)病率和患病率還在不斷增加。在已確認的可引起過敏反應(yīng)的160多種食物中，有8種被認為與90%食物過敏有

3、關(guān)。這些“主要的食品過敏原”包括牛奶、蛋類、魚、甲殼動物貝類、堅果、小麥、花生和大豆[34]。為保護消費者安全及向消費者提供更多信息，多國立法規(guī)定食品包裝袋上需要標(biāo)注過敏原。另一方面，提高現(xiàn)有食品過敏原的檢測分析方法，并制定新的標(biāo)準(zhǔn)化方法，為食品和餐飲業(yè)提供適當(dāng)?shù)墓ぞ咭约盀椤笆称愤^敏”消費者提供“無過敏原”食品也是避免食物過敏重要的途徑。本文對基于蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）的檢測方法在食品過

4、敏原檢測中的應(yīng)用進行了介紹，如免疫化學(xué)法、蛋白質(zhì)組學(xué)方法、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）等，及對食品過敏原檢測方法的發(fā)展進行了探討。1食品過敏原成分檢測的靶目標(biāo)分子食品過敏原成分檢測主要依賴于過敏原自身或過敏原成分的標(biāo)記分子。通常有兩類標(biāo)記分子用于檢測過敏原：過敏原成分中的特征性蛋白和能表征過敏成分的特定的DNA序列。由于蛋白靶標(biāo)和DNA靶標(biāo)各有利弊，因此應(yīng)根據(jù)食品自身進行選擇。一般選擇某種靶分子

5、的重要依據(jù)在于其在樣品中的豐度，這將影響到檢測方法的靈敏性。蛋白同源性也是重要參考因素，當(dāng)選擇某種蛋白作為靶分子檢測不同物種中的過敏原時，應(yīng)選擇保守性較高的同源蛋白。盡管蛋白檢測方法比較常用，但蛋白成分容易受到食品加工和外界變化的影響，如季節(jié)和地理的影響；熱加工也會降低目的蛋白溶解度。而DNA分子則具有更好的穩(wěn)定性，且不受表型變異影響，因此更有助于定量分析及用于對敏感性要求較高的場合。在DNA靶標(biāo)中，常用的靶向分子包括單拷貝或多拷貝分子

6、，如線粒體、葉綠體或其他高度重復(fù)序列。由于多拷貝分子在樣品中數(shù)量較多，其可提高分析敏感性，而單拷貝基于蛋白質(zhì)和DNA的食品過敏原檢測技術(shù)的研究進展丁亮，付琳，吳秀蓮，李夢雪（南京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局高淳區(qū)質(zhì)量計量檢測所，江蘇南京211300）摘要：目前，食品過敏問題已成為全球性的健康問題。在食品加工過程中產(chǎn)生的食品過敏成分或微量過敏原對敏感機體都是巨大的健康威脅。因此，可靠的分析方法是鑒別和檢測食品中過敏成分所必需的。該文綜述了基于蛋白質(zhì)和

7、脫氧核糖核酸(DNA)的食品過敏原檢測技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展，并展望了其未來發(fā)展趨勢。關(guān)鍵詞：食品過敏原；蛋白質(zhì)；脫氧核糖核酸；檢測中圖分類號：TS207.3文章編號：02545071（2017）07015704doi:10.11882j.issn.02545071.2017.07.034RecentadvanceofdetectiontechnologyoffoodallergensbasedonproteinDNADINGLiangFUL

8、inWUXiulianLIMengxue(GaochunTestingInstituteofQualityMetrologyNanjingBureauofQualityTechnicalSupervisionNanjing211300China)Abstract：Atpresentfoodallergieshavebecomeglobalhealthconcern.Thefoodallergenicingredientsmicroall

9、ergensproducedduringfoodprocessingwereahugehealththreatonsensitiveindividuals.Therefethereliableanalyticalmethodsarenecessarytoidentifydetectallergenicingredientsinfood.Theapplicationdevelopmentoffoodallergendetectiontec

10、hnologybasedonproteindeoxyribonucleicacid(DNA)weresummarizedthefuturedevelopmenttrendwasprospected.Keywds：foodallergensproteindeoxyribonucleicaciddetection收稿日期：20170510作者簡介：丁亮（1988），男，助理工程師，本科，研究方向為食品檢測。經(jīng)驗交流157中國釀造2017年第

11、36卷第7期總第305期杏仁中Prudu5（也叫酸性核糖體蛋白P2）過敏原的編碼序列從其相關(guān)產(chǎn)品中鑒別杏仁。INIESTOE等[18]研究了烘焙、高壓和蒸汽滅菌處理對榛子過敏原編碼序列的影響，結(jié)果表明，熱處理、烘焙、蒸汽滅菌都可降低榛子DNA檢測能力，這是由于DNA提取率和DNA完整性降低。由于某些食品的組成成分可能抑制PCR反應(yīng)，其會影響qPCR對過敏成分的定量檢測[19]。在DNA提取和純化之前向食品中加入內(nèi)標(biāo)物將有助于提高定量結(jié)果

12、的可信度，因為食品成分對DNA提取和純化的影響可通過對內(nèi)標(biāo)物的影響估量。3.3高分辨熔解分析高分辨率熔解度分析（highresolutionmeltinganalysis，HRM）是通過檢測溫度升高時PCR擴增產(chǎn)物逐漸熔解產(chǎn)生的熒光變化，分析樣品中DNA產(chǎn)物[20]。隨著高分辨率儀器和飽和熒光DNA結(jié)合染料的發(fā)展，HRM分析已被用于基因分型、表觀遺傳學(xué)、食品檢測研究。因特定PCR產(chǎn)物的熔融溫度（Tm）可用于在種屬水平區(qū)分食品，HRM分析

13、已被用于食品成分鑒定。COSTAJ等[21]利用HRM結(jié)合實時PCR通過檢測杏仁中的Prudu5過敏蛋白編碼基因從加工食品中檢測到微量杏仁。MART魱NFERN魣NDEZB等[22]利用HRM可將小麥與其他谷物（如大麥、黑麥和燕麥）區(qū)分開。加工食品產(chǎn)物中榛子也可被DNA條形碼HRM定量，檢測限達0.01%[23]。3.4連接依賴探針擴增連接依賴探針擴增（ligationdependentprobeamplification，LPA）是基

14、于兩個熒光標(biāo)記的寡核苷酸片段探針，與靶序列DNA進行雜交，然后連接擴增，分析產(chǎn)物。僅當(dāng)兩個寡核苷酸探針分別與靶序列完全互補時，連接酶才能將兩段探針連接成一條完整的核酸單鏈，隨后產(chǎn)生特定大小的擴增產(chǎn)物，通過毛細管電泳鑒別[24]。LPA已用于檢測10種不同的過敏成分[25]。在不同的矩陣測試時，LPA可鑒別單一過敏原，檢測限達5mgkg。與內(nèi)部陽性對照信號相比，8種過敏成分信號的檢測限范圍為5～400基因拷貝數(shù)[26]。3.5DNAarr

15、ays為進行多重檢測，許多芯片被用于檢測PCR產(chǎn)品，并用于檢測食品中的過敏成分。ROSSIS等[27]使用肽核酸（peptidenucleicacids，PNAs）芯片檢測擴增的花生和榛子DNA。PNAs是結(jié)合到互補DNA序列的寡核苷酸類似物，較其同源DNA表現(xiàn)出更高的親和力和特異性[28]。電化學(xué)DNA芯片可檢測榛子中兩個不同過敏原的特異性DNA片段，且樣品濃度可在納摩爾水平。WANGW等[29]在含硅的表面開發(fā)出一種光學(xué)薄膜微陣列方

16、法，可在兩個tetraplexPCR系統(tǒng)中同時檢測8種食物過敏成分，如同時檢測腰果、花生、小麥、大豆、魚、雞、蝦和牛肉，及同時檢測芝麻、燕麥、杏仁、芹菜、榛子、核桃、羽扇豆和芥末[30]。此時，信號可肉眼觀察而不需額外的儀器。從榛子、花生和大豆DNA擴增的地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，可利用5′生物素探針雜交檢測，該探針可被鏈霉親和素修飾的數(shù)字化視頻光盤（digitalvideodisk，DVD）表面固定，檢測限達1μgg[31]?；?′S

17、H和3′生物素標(biāo)記莖環(huán)雙探針的電化學(xué)DNA傳感器，也可通過檢測Arah1基因的片段來檢測花生是否存在，檢測限為0.35fmolL，線性響應(yīng)范圍1015～1010molL。DNA傳感器可在未進行PCR擴增的情況下定量檢測花生乳飲料的DNA提取物[32]。4結(jié)束語如今，為了保護過敏機體免受過敏原反應(yīng)的困擾，人們提倡減少接觸任何過敏原的機會。但由于加工食品通常還有各種各樣的成分，包括潛在的過敏原，使得很難完全不接觸過敏原。因此，食品過敏原的檢

18、測是當(dāng)前食品安全的重要任務(wù)。由于依賴蛋白質(zhì)檢測方法的復(fù)用能力及質(zhì)譜儀器的新發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)方法正被廣泛替代傳統(tǒng)的免疫化學(xué)方法和基于DNA的PCR法。同樣的，多種DNA檢測新技術(shù)正蓬勃發(fā)展，如HRM、LPA和DNA芯片。除上述幾種方法外，寡合苷酸適體，即結(jié)合多種目標(biāo)物的單鏈或RNA寡核苷酸，也逐步作為抗體的另一選擇應(yīng)用于生物分析，目前已有多種適體用于食品過敏原的檢測；生物傳感器，特別是新型納米材料，也逐步用于檢測食品過敏原。在食品中的過敏

19、成分檢測中，為得到可靠的具有可比性的分析結(jié)果，還需要驗證及協(xié)調(diào)各分析方法。同樣地，對于新開發(fā)的快速檢測方法，如基于生物傳感器的方法，也需要進行驗證，及評估其真實食品樣品中的適用性。參考文獻：[1]TOSCAMASILVESTRIMOLCESERetal.AllergenspecificIgEtofoodmolecularcomponentsage:Fromearlychildhoodtoadulthood[J].AllergolImmu

20、nopathol201745(1):8792.[2]GASILOVANGIRAULTHH.Bioanalyticalmethodsffoodallergydiagnosisallergendetectionnewallergendiscovery[J].Bioanalysis20157(9):11751190.[3]森山逹哉，趙欣.大豆過敏源的多樣性及味噌的低過敏性驗證[J].中國釀造，2015，34（3）：166.[4]LUBERFD

21、EMMELAHERBERTDetal.ComparativeassessmentofDNAbasedapproachesfthequantificationoffoodallergens[J].FoodChem2014160:104111.[5]張詩堯，趙元，鮑男，等.大豆球蛋白直接ELISA檢測方法的建立與初步應(yīng)用[J].大豆科學(xué)，2016，35（4）：660665.[6]何方洋，于信念，王坤，等.酶聯(lián)免疫法與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測豬

22、肉中沙丁胺醇[J].中國釀造，2015，34（8）：132135.[7]IVENSKOBAUMERTJLTAYLSL.Commercialmilkenzymelinkedimmunosbentassay(ELISA)kitreactivitiestopurifiedmilkproteinsmilkderivedingredients[J].JFoodSci201681(7):T1871T1878.[8]KHUDASESHARMAGMGA