紅茶菌混合菌種的分離與鑒定

1、※基礎(chǔ)研究——是邑垂!示，第8～18h為菌體生長對數(shù)期，效價迅速增加；此后菌體生長和產(chǎn)物形成進入穩(wěn)定期。由此可見，P一99菌株發(fā)酵呈現(xiàn)明顯的初級代謝動力學(xué)特征，可用Logistic方程和Luedeking—Pimt模型分別對菌體細胞生長(ODx)和產(chǎn)物(P)形成動力學(xué)進行模擬【6】，得菌體細胞生長動力學(xué)方程為：ln(ODx／(0836一ODx))=0464t一5034，r=09499；產(chǎn)物乳鏈菌肽形成動力學(xué)方程為：ln((P101694

2、)／(210787一P))=0464t一5034，r=09964。8營下發(fā)酵良好，通氣量和Ca2、Zn2、Fez等對金屬離子對其細胞生長與乳鏈菌肽的產(chǎn)生無明顯影響，但Mn2對乳鏈菌肽的產(chǎn)生有促進作用，而Cu2則有較強的抑制作用；在含1％蔗糖的M17培養(yǎng)基，該菌株產(chǎn)乳鏈菌肽表現(xiàn)出初級代謝動力學(xué)特征，其菌體生長動力學(xué)方程為：ln(ODx／(o836一ODx))=0464t一5034，r09499；產(chǎn)物生成動力學(xué)方程為：ln((P101694

3、)／(210787P))=0464t5034。r=09964。菌體濃度pH10效價參考文獻：25002o0o津l500$10005000O246810121416182O2224時間0a)圖3培養(yǎng)時間對P一99菌株細胞生長與產(chǎn)乳鏈菌肽的影響本文從鮮奶中篩選到一株乳鏈菌肽產(chǎn)生菌——乳鏈球菌P一99，該菌株在M17培養(yǎng)基、30~C、pH65條件[1】[2】【31[4】[5】[6】Delves—bmughtonJNisinanditsuses

4、asafoodpreservative[J】FoodTechnol，1990，44：100117中華人民共和國衛(wèi)生部中國食品添加劑IM]199436TerzaghiBE，SandineWEImprovedmediumforlacticstreptococciandtheirbacteriophages[J1ApplMierobiol。1975，29：807—809彭沈軍，李東，孫健生物食品防腐劑乳酸鏈球菌素菌種篩選與鑒定[J】中國食品添

5、加劑，1995，(3)：69吳瓊?cè)殒溇男r測定方法的研究【J】食品科學(xué)，1996，(6)：5659熊宗貴發(fā)酵工藝原理【M】北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2001170—17】紅茶菌混合菌種的分離與鑒定吳薇，蓋寶川，籍保平(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083)摘要：本文對來自北京的某個紅茶菌進行了菌種分離和鑒定，作者從該紅茶菌中分離得到了五個菌種，經(jīng)鑒定分別為巴斯德酵母(SaccharomycespastorianusHa

6、nsen)、粟酒裂殖酵母(SchizosaccharomycespombeLindner)、醋化醋桿菌木質(zhì)亞種(Acetobacterxylinum)、甲醇酸單胞菌(Acidomonasmethanolica)、乳桿菌科乳桿菌屬(LactobaciUus)。關(guān)鍵詞：紅茶菌；菌種分離；菌種鑒定StudyontheIsolationandIdentifiationofMicrobesofKombuchaWUWei，GAIBao—chuan，

7、JIBao—ping(CollegeofFoodScienceandNutritionalEngineering，ChinaAgricultureUniversity，Beijing100083，China)Almrt~：ThispaperintroducedtheisolationandidentificationofmicroorganismsfromakindofKombucha1“nerew口efive收稿日期：2003一10—

8、15通訊聯(lián)系人作者簡介：吳薇(1970一)，講師，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。維普資訊※基礎(chǔ)研究食品重犖2004VoL25No457MnSO。4HO005g，檸檬酸銨50g，蒸餾水1L。L4號(MRS培養(yǎng)基，分離乳桿菌)：蛋白胨100g，酵母提取物50g，肉浸膏100g，吐溫80lml，葡萄糖200g，K2HPO420g，MgSO4。7H20058g，MnSO4。4H20025g，乙酸鈉50g，檸檬酸二銨20g，蒸餾水1L，調(diào)

9、pH62～64。12試驗方法菌種分離方法：將己活化的紅茶菌混合菌種振蕩混勻，吸10ml菌液并夾取一小塊菌膜入帶玻璃珠的90ml無菌水中，充分振蕩，使溶液混勻。后吸取5ml入45ml無菌水中，依次稀釋成10—2，10—3，10一，10‘5，10一，之后分別吸后3個稀釋度的菌液各01ml到不同的分離培養(yǎng)基中，用刮刀涂勻。每個稀釋度重復(fù)3次。醋酸菌和乳酸菌培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)，酵母菌培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)。觀察生長情況，鏡檢初篩。產(chǎn)膜醋酸菌的分離：

10、將己活化的混合菌種適量接入茶糖水(紅茶3％蔗糖20％)中，30℃靜止培養(yǎng)，待其表面長出菌膜后，在菌膜上放置一至兩塊無菌濾紙后繼續(xù)培養(yǎng)，2d后取出濾紙，接入醋酸菌培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)。一周后，平板上出現(xiàn)菌膜。將菌膜挑入有玻璃珠的無菌水中振蕩破碎，并逐級稀釋，后涂平板分離。30℃培養(yǎng)6d后，將稀釋平板上出現(xiàn)的透明區(qū)域(醋酸菌產(chǎn)生的乙酸與碳酸鈣反應(yīng)生成可溶性的乙酸鈣)上的幾種菌落分別挑單菌落入醋酸菌液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，3～4d后觀察，

11、表面出現(xiàn)白色菌膜的即為產(chǎn)膜醋酸菌。13試驗結(jié)果從混合菌種中共分離得到5株菌種，它們分別是：兩株酵母菌，代號分別為Y11和Y13：一株產(chǎn)膜的醋酸菌，代號為M；一株不產(chǎn)膜的醋酸菌，代號為A22：一株乳酸菌，代號為L11。2菌種的鑒定21菌種鑒定用培養(yǎng)基211菌種培養(yǎng)基Y1號培養(yǎng)基(Y11和Y13用)，A1號培養(yǎng)基(M和A22用)，MRS培養(yǎng)基(L11用)。212醋酸鈉培養(yǎng)基葡萄糖0062g，膘025g，醋酸鈉(三結(jié)晶水)05g，瓊脂20g，

12、蒸餾水100ml。213硝酸鹽利用培養(yǎng)基無氮合成培養(yǎng)基100ml(葡萄糖2％，豆芽汁05ml，KH2PO401％，MgSO47H2O007％，瓊脂2％)，硝酸鉀01％。214糖類發(fā)酵培養(yǎng)基酵母浸粉05％，葡萄糖，半乳糖，乳糖，麥芽糖，蔗糖，棉子糖各10％。215乙醇氧化和乙酸氧化測定用培養(yǎng)基酵母膏1％，碳酸鈣1％，自來水100ml，瓊脂2％，乙醇2％。216碳源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基MgSO7HO02g，fNH02SO420g，NaH2PO‘H

13、2O05g，K2HPO05g，CaCl22H2O019，蒸餾水1000m1。217硫化氫測定用培養(yǎng)基胰蛋白東10g，NaC15g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，半胱氨酸04g，葡萄糖2g，蒸餾水1000ml。218乳酸測定用培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基。22試劑與試紙氧化酶試紙(1％鹽酸二甲基對苯撐二胺)；23％～10％的過氧化氫；硫化氫測定用乙酸鉛試紙(50～100gtL的乙酸鉛)；乳酸測定用展開劑：水：苯甲醉：正丁醇以1：5：5的量相混合，然

14、后加1％的甲酸；乳酸測定用顯色劑：004％的溴酚藍乙醇溶液，用01N的NaOH調(diào)pH到67。23測定與鑒定方法【6~81革蘭氏鑒別染色法；酵母的子囊孢子觀察方法；硝酸鹽利用情況的測定方法；糖類發(fā)酵情況的測定方法；氧化酶測定；接觸酶測定；乙醇氧化和乙酸氧化測定；乙醇為唯一碳源的測定；從葡萄糖產(chǎn)乳酸測定(紙層析法)；產(chǎn)HS的測定。24鑒定結(jié)果Y11的形態(tài)及生理生化特征是：典型酵母狀的細胞，子囊孢子不呈針形，子囊含孢子1～4個。無性繁殖出芽式

15、，出芽多邊發(fā)生，不常形成假菌絲。孢子圓形或卵形，發(fā)酵力強，不能利用硝酸鹽。發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和2，3棉子糖。以上特征根據(jù)《真菌鑒定手冊》【91，將Y11鑒定為巴斯德酵母(口ccJl口，D，，lycPpastorianusHansen)。Y13的形態(tài)及生理生化特征是：圓柱狀的營養(yǎng)細胞，(6～16)(3～5)uin。子囊孢子不呈針形，子囊含孢子1～4個。子囊孢子圓形，光滑，直徑2～25uin。無性繁殖裂殖式。以上特征根據(jù)《真菌鑒定手冊

16、》【，將Y13鑒定為粟酒裂殖酵母(SchizosaccharomycespombeLindner)。M的形態(tài)及生理生化特征是：好氧革蘭氏陰性桿菌，從葡萄糖產(chǎn)酸，從乙醇產(chǎn)乙酸，能產(chǎn)生纖維素膜，不能以乙醇作為唯一碳源生長，以上特征根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》【，將M鑒定為醋化醋桿菌木質(zhì)亞種(Acetobacterxylinum)。A22的形態(tài)及生理生化特征是：好氧革蘭氏陰性桿菌，從葡萄糖產(chǎn)酸，能氧化乙醇到乙酸，能氧化乙酸到二氧化碳和水，氧化酶陽