1.3copyc型hbv轉基因小鼠的制備研究

1、南方醫(yī)科大學碩士學位論文1.3copyC型HBV轉基因小鼠的制備研究姓名：黃黎珍申請學位級別：碩士專業(yè)：醫(yī)學實驗動物學指導教師：顧為望20070501摘要因1 ．3 c o p y H B V 與報道一致。取其中1 ．0 c o p y 與報道的C 基因型參照序列進行比對，同源性達9 8 ％，證實目的基因為c 基因型。然后進行質粒的大量提取，S m aI 酶切后對照孔膠和回收孔膠同時電泳，對照孔膠進行染色，回收孔膠與之參照即可切下目的片

2、段，4 ．1 k b 大小的D N A 目的片段H B V ( C ) I - 3 經(jīng)回收純化，稀釋成3 n g ／p l的注射用D N A 溶液。選4 ．5 周齡發(fā)育良好的F V B ／N 母鼠，腹腔注射5 I U 孕馬血清( p r e g n a n tm a r cs e r u m g o n a d o 仃o p i n , P M S G ) ，4 8 h 后注射5 I U 人絨毛膜促性腺激素( h u m a nc h

3、o f i o n i cg o n a d o 仃o p i n , H C G ) ，激素超排處理后與F V B ／N 公鼠l ：1 合籠，次日清晨檢陰栓陽性為顯微注射用受精卵供體鼠。將結扎K M 公鼠與正常K M 母鼠合籠，選取有陰栓且陰門腫脹、紅潤的母鼠做為注射后受精卵移植的受體鼠。將H a Y ( C ) 1 ．3 D N A 溶液利用原核顯微注射的方法直接注入超排得到的F V B ／N 單細胞受精卵的原核內(nèi)，取注射存活的受精

4、卵移植到假孕K M 母鼠的輸卵管內(nèi)。待其懷孕產(chǎn)仔后，分別從H B V 基因組的整合、復制及表達等方面對仔鼠進行鑒定：①抽提仔鼠鼠尾基因組D N A ，采用P C R 技術進行外源D N A 整合分析，P C R 產(chǎn)物經(jīng)電泳分析鑒定陽性條帶。②進行小鼠眼眶后靜脈叢采血，取血清進行血清H B s A g 和H B e A g E L I S A 檢測和H B VD N A 定量P C R 檢測，以檢測髓VD N A在血清的表達和復制情況。③

5、取肝臟組織制作切片，以抗H B s 和抗H B c 進行肝臟組織H B s A g 和H B c A g 的免疫組化檢測，以檢測H B V D N A 在肝臟組織的表達。本研究共注射受精卵2 8 4 0 枚，篩選注射后成活的受精卵共2 2 5 6 枚，注射成活率為7 9 ．4 ％。注射完后立即將注射存活的受精卵移植假孕K M 雌鼠，共移植假孕雌鼠8 5 只，其中有4 2 只懷孕，假孕雌鼠妊娠率為4 9 ％，共產(chǎn)下F O 代小鼠1 6 8

6、 只，P C R 檢測共有1 4 只陽性，其中血清H B s A gE L I S A 檢測陽性有5只，H B e A g 檢測均陰性。血清H B V D N A 熒光定量P C R 顯示，其中2 只小鼠的拷貝數(shù)大于1 0 2 c o p y ／m l 。經(jīng)傳代產(chǎn)下F 1 代小鼠6 1 只，P C R 檢測陽性5 只，H B s A gE L I S A 檢測陽性4 只，其中肝臟H B s A g 免疫組化陽性有2 只，而H B c A