共表達tcrα122和tcrvβ7.1重組腺病毒載體的構(gòu)建及其殺傷肝癌細胞作用的研究

1、廣東藥學(xué)院碩士學(xué)位論文共表達TCRα12-2和TCRVβ7.1重組腺病毒載體的構(gòu)建及其殺傷肝癌細胞作用的研究姓名：王俊偉申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：黃樹林200805011 摘 要 摘 要 目的： 目的： 研究雙表達 TCRα12-2 和 TCRVβ7.1 基因的重組腺病毒載體感染的 PBMC對肝癌細胞的殺傷作用，為以后的 TCR 抗腫瘤研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 方法：主要包括三方面：一、

2、腺病毒穿梭質(zhì)粒 pDC315-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1的構(gòu)建。提取外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）總 RNA，RT-PCR 得到 TCRα12-2 基因。TCRVβ7.1 基因由 pCDNA3.1-Vβ7.1 擴增獲得，將這兩個基因以 IRES 相連克隆入腺病毒穿梭質(zhì)粒 pDC315 中得到pDC315-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1 。 二、重組腺病毒

3、 Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1 的包裝及鑒定。穿梭質(zhì)粒pDC315-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1 和腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 HEK293 細胞，包裝出可同時表達 TCRα12-2 和 TCRVβ7.1 基因的重組腺病毒。然后提取病毒基因組 DNA，對外源目的基因進行 PCR 鑒定；病毒感染宮頸癌細胞（HELA） ，48 小時后提取細胞總 RNA，RT-PCR 鑒定目的基因表達；最后病毒感染 PBMC，用流式細胞儀

4、檢測目的蛋白的表達。鑒定正確的病毒命名為 Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1并進行大量擴增，用 TCID50 法測定滴度。 三、MTT 和流式細胞儀檢測 Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1 感染的 PBMC 對肝癌細胞的殺傷作用。用包裝好的病毒 Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1 和對照病毒Ad-GFP 分別感染 PBMC， 感染 24 小時后和未處理的 PBMC 分別作用于兩株肝癌細胞 BEL-7402

5、和 HepG2。48 小時后用 MTT 和流式細胞儀檢測殺傷效果。 結(jié)果： 結(jié)果：酶切和測序結(jié)果證明腺病毒穿梭質(zhì)粒 pDC315-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1構(gòu)建正確并且包裝成功。PCR 從重組病毒基因組中擴增出目的基因 TCRα12-2和 TCRVβ7.1，說明目的基因整合到病毒中。RT-PCR 和流式細胞儀檢測表明目的基因可以有效的表達。Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1 感染 PBMC 組對腫瘤細胞的殺傷率明