蟾毒靈新型蛋白聚合物納米載體的制備及其體內外評價.pdf

1、蟾毒靈是一種水溶性差的具有廣譜抗腫瘤活性的中藥單體，但是，其體內半衰期短，且有心臟毒性。因此，為攻克這些難題，本課題以聚氰基丙烯酸烷酯類納米載體作為內殼，模擬脂蛋白結構特征，在納米粒外表面包載修飾有靶向配基的親水蛋白，構建新型“觸發(fā)式”蛋白聚合物納米載體。本課題就蟾毒靈納米載體的制備、載藥性能、生物相容性、靶向性以及藥效學等為考察方向展開工作，全文分為五項內容:
　　第一項綜述
　　綜述分兩個部分內容系統(tǒng)闡釋，首先簡單介紹了

2、蟾毒靈對多種癌癥的抗腫瘤活性，其次簡單綜述了蟾毒靈相關納米制劑研究進展以及聚氰基丙烯酸烷酯類載體在藥物轉運系統(tǒng)的應用。這兩個部分內容契合本課題的研究內容，為后續(xù)實驗工作的展開提供了理論依據(jù)。
　　第二項處方前研究
　　處方前研究建立了蟾毒靈HPLC體外分析方法，實驗結果顯示此方法具有較好的專屬性，1、10、20μg/mL三個濃度的蟾毒靈樣品日間精密度及日內精密度分別為1.442％與1.846％、0.692％與1.286％以及

3、0.450％與0.256％，平均回收率依次為100.728±0.347％，100.767±1.128％和95.642±0.271％，各自的RSD％均小于2％，精密度與準確度較高，定量限為100 ng/mL，檢測限為40ng/mL。高、中、低濃度的蟾毒靈樣品溶液在4℃條件下儲存72h，穩(wěn)定性良好。室溫條件下，蟾毒靈在水中的表觀溶解度為40.406±0.852μg/mL;酸穩(wěn)定性結果顯示蟾毒靈長時間處于酸性條件下會降解。但6h內穩(wěn)定性仍較好

4、。
　　第三項制備優(yōu)化及質量評價
　　本部分制備蟾毒靈聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒(BF-PBCA-NPs)，并以此為內殼，以熊去氧膽酸修飾的牛血清白蛋白為親水外殼，制備蛋白聚合物“觸發(fā)式”納米載體(PPN)。利用單因素及中心復合設計法優(yōu)化處方:BCA=60μL和F127∶PVA=1∶1（W/W，M總=150mg）。最佳工藝驗證結果顯示，BF-PBCA-NPs的包封率為71.287±2.303％，藥物濃度為499.011±16.

5、123μg/mL，平均粒徑為149.3±0.6nm;蟾毒靈蛋白聚合物“觸發(fā)式”納米載體(B-PPN)的包封率為69.185±3.047％，藥物濃度為484.295±21.327μg/mL，平均粒徑為155.2±0.3nm，蛋白載負率高達94.406±1.651％。所制得的BF-PBCA-NPs及B-PPN大小較為均勻，呈規(guī)則圓球形，B-PPN表面較為光滑。物理化學表征結果:DSC圖譜顯示蟾毒靈是以無定型形態(tài)存在于納米載體中，F(xiàn)TIR圖譜

6、表明蟾毒靈是共價結合在納米載體的內部，而不是吸附在載體表面。體外釋放試驗結果顯示以PBCA納米粒作為藥物載體具有緩釋作用，在納米粒外表面包裹修飾蛋白可增強緩釋作用。
　　第四項藥物動力學及用藥安全性研究
　　建立HPLC分析法用于體內藥物動力學研究，并研究各制劑的用藥安全性以及在大鼠體內的藥物代謝情況。方法學驗證結果顯示所建立的HPLC分析法滿足測定要求。溶血性試驗與血管刺激性試驗均證實PBCA納米載體能夠增強用藥安全性，P

7、BCA納米載體表面包裹修飾蛋白，生物相容性最好。體內藥物動力學研究發(fā)現(xiàn)納米粒制劑組SD大鼠體內各時間點所對應的血藥濃度均比蟾毒靈原料藥組所對應的血藥濃度高，蟾毒靈原料藥組半衰期為1.821±0.223h，而BF-PBCA-NPs以及B-PPN的體內半衰期分別為4.349±0.343h與5.495±0.193h，在同等給藥劑量下，BF-PBCA-NPs的平均滯留時間是蟾毒靈游離藥的1.506～2.867倍，而B-PPN的平均滯留時間是蟾毒

8、靈游離藥的1.880～3.361倍，兩者的生物利用度依次為262.218％與359.398％。
　　第五項組織分布學
　　建立HPLC分析法用于組織分布學研究，并研究各制劑在小鼠體內組織分布情況。所建立的色譜條件不會干擾小鼠生物樣品中蟾毒靈及內標物質的測定，專屬性良好，且小鼠血漿以及心、肝、脾、肺、腎、腫瘤等組織中所檢測的蟾毒靈在0.05～5μg/mL濃度范圍內均具有良好的線性。日內、日間精密度分別為1.182％-5.993

9、％與0.722-9.327％，小鼠血漿樣品及組織樣品中蟾毒靈的平均方法回收率為82.811-100.481％，平均絕對回收率為80.510-96.798％，RSD均小于10％，具有較高的精密度及準確度，可用于含量測定。最低定量限為65.0ng/mL，最低檢測限為33.5ng/mL，蟾毒靈小鼠血漿樣品以及心、肝、脾、肺、腎、腫瘤等各組織樣品在72h內穩(wěn)定。蟾毒靈原料藥、BF-PBCA-NPs與B-PPN的組織藥物濃度依次為心＞腎＞肝＞肺＞

10、脾＞腫瘤，腎＞肝＞肺＞腫瘤＞心＞脾以及腎＞肺＞肝＞脾＞腫瘤＞心。制劑組各時間點的血藥濃度均顯著比原料藥組高(P＜0.05)。PPN與PBCA納米載體可以減少蟾毒靈在心臟的分布，蟾毒靈制劑在心臟組織的藥物濃度與原料藥相比較低，且無時間依賴性，基本維持在0.2μg/g以下。制劑組在肝、脾、肺等器官的組織藥物濃度均比原料藥組高，且B-PPN組在這幾個組織所檢測到的藥物含量均高于BF-PBCA-NPs組，說明B-PPN能夠比BF-PBCA-NP

11、s更好的發(fā)揮器官靶向性。
　　第六項體內抗腫瘤藥效學與心臟毒性研究
　　該部分主要研究蟾毒靈原料藥以及蟾毒靈制劑在ICR荷瘤小鼠體內的腫瘤抑制作用與對心臟的毒性作用。蟾毒靈原料藥、BF-PBCA-NPs以及B-PPN均具有不同程度的抗腫瘤作用，在給藥量相同的情況下，BF-PBCA-NPs組與B-PPN組的腫瘤體積生長速度比蟾毒靈原料藥組緩慢，B-PPN組荷瘤小鼠的腫瘤生長速度最慢，腫瘤抑制率結果顯示BF原料藥組的抑瘤率為48