富血小板血漿應(yīng)用于兔顱骨組織工程的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：口腔頜面部經(jīng)常需要進(jìn)行大塊的骨缺損修復(fù)。自體骨移植來(lái)源有限并造成供區(qū)創(chuàng)傷,異體骨移植可能傳播疾病或存在免疫反應(yīng)。組織工程(tissue engineering,TE)能進(jìn)行有效的骨組織重建而成為修復(fù)骨缺損的最有前景的方法。骨組織工程通常是將體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)接種在組織工程支架上,而后植入骨缺損區(qū)。BMSCs體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基中需加入動(dòng)物血清作為提供各種營(yíng)養(yǎng)和細(xì)胞因

2、子的必須物質(zhì),動(dòng)物血清可能引起免疫反應(yīng)和疾病傳播等問(wèn)題。盡管有學(xué)者嘗試過(guò)采用無(wú)血清培養(yǎng)基,但結(jié)果并不理想。富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)來(lái)源于自體,排除了免疫反應(yīng)的可能,有望取代以前用動(dòng)物血清培養(yǎng)而可能帶來(lái)的免疫反應(yīng)和疾病傳播等問(wèn)題,從而解決了骨組織工程的相關(guān)難題。
　　 在組織工程領(lǐng)域,生長(zhǎng)因子的作用越來(lái)越多地受到關(guān)注和重視。PRP中的血小板在凝血酶的作用下發(fā)生脫顆粒反應(yīng)而釋放各種生長(zhǎng)因子,這

3、些生長(zhǎng)因子比例協(xié)調(diào),能產(chǎn)生最有效的相互作用,從而促進(jìn)骨組織的再生。結(jié)構(gòu)上,PRP與常用于組織工程的纖維膠及藻酸鹽相似,能為細(xì)胞提供三維的生長(zhǎng)環(huán)境。PRP正在成為組織工程新的熱點(diǎn)而被臨床醫(yī)生和研究學(xué)者所重視。盡管PRP復(fù)合其它支架材料在組織工程中已有應(yīng)用,其單獨(dú)作為骨組織工程的支架還很少報(bào)道。
　　 本研究對(duì)比分析不同制備方法及不同存放時(shí)間對(duì)富血小板血漿的影響,探討PRP對(duì)培養(yǎng)、誘導(dǎo)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨活性的影響,并在分析PRP微觀

4、結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,利用PRP凝膠作為支架復(fù)合經(jīng)過(guò)地塞米松誘導(dǎo)或未經(jīng)誘導(dǎo)的BMSCs以及單純的PRP凝膠修復(fù)兔顱骨缺損,以期把PRP作為一種具有良好生物學(xué)活性而且安全、有效的培養(yǎng)基提供給骨組織工程研究與臨床應(yīng)用,并評(píng)價(jià)來(lái)源于自體的PRP凝膠作為骨組織工程支架的可行性,以及PRP在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)BMSCs有無(wú)誘導(dǎo)功能及其單獨(dú)應(yīng)用有無(wú)促進(jìn)成骨的作用,旨在為富血小板血漿在口腔頜面骨組織工程的應(yīng)用奠定初步的理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1

5、、采用不同離心力及離心時(shí)間制備PRP,探討不同離心力及離心時(shí)間對(duì)PRP血小板富集系數(shù)及血小板活化的影響。通過(guò)測(cè)定不同存放時(shí)間后血小板形態(tài)變化及PRP釋放的生長(zhǎng)因子數(shù)量,評(píng)價(jià)不同存放時(shí)間對(duì)PRP的影響。通過(guò)分析PRP凝膠微觀結(jié)構(gòu)、孔隙率等特點(diǎn),從結(jié)構(gòu)上評(píng)價(jià)PRP作為骨組織工程支架的可行性。
　　 2、采用密度梯度離心法與全骨髓培養(yǎng)方法分離、培養(yǎng)BMSCs,對(duì)比分析兩種方法對(duì)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。采用不同濃度自體PRP培養(yǎng)液替代

6、動(dòng)物血清體外培養(yǎng)BMSCs,探討PRP濃度對(duì)BMSCs增殖速度的影響。采用不同濃度PRP單獨(dú)或聯(lián)合成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)BMSCs,通過(guò)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、鈣結(jié)節(jié)染色及ALP、骨鈣素(osteocalcin,OC)定量測(cè)定,評(píng)價(jià)PRP單獨(dú)或聯(lián)合誘導(dǎo)液誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的功能及其與PRP濃度的關(guān)系。
　　 3、在兔顱骨制備直徑為5mm的全層骨缺損區(qū),利用PRP凝膠作為支架復(fù)合經(jīng)過(guò)地

7、塞米松誘導(dǎo)的或未經(jīng)誘導(dǎo)的BMSCs,全血復(fù)合經(jīng)過(guò)地塞米松誘導(dǎo)的或未經(jīng)誘導(dǎo)的BMSCs以及單純的PRP凝膠修復(fù)兔的顱骨缺損。8周后,分離顱骨標(biāo)本。通過(guò)大體檢查、拍攝X線片、計(jì)算骨修復(fù)區(qū)與相鄰正常顱骨的骨密度評(píng)分比值、組織學(xué)檢測(cè)等方法分析缺損區(qū)骨修復(fù)情況。以評(píng)價(jià)來(lái)源于自體的PRP凝膠作為骨組織工程支架的可行性及PRP在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)BMSCs有無(wú)誘導(dǎo)功能及其單獨(dú)應(yīng)用有無(wú)促進(jìn)成骨的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1、離心制備PRP時(shí),

8、采用兩次離心法,每次離心力200g、離心時(shí)間10分鐘能在保證血小板質(zhì)量的同時(shí),獲得較高的血小板富集系數(shù)。隨存放時(shí)間延長(zhǎng),PRP中血小板形態(tài)上逐漸呈現(xiàn)出活化的趨勢(shì),但并未影響轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforminggrowth factor-β,TGF-β)和血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)的釋放。PRP凝膠有大量孔隙,孔隙率為84.12％,電鏡下可見(jiàn)孔隙的直徑從數(shù)十微米至數(shù)百

9、微米不等,各孔隙互相交通。
　　 2、PRP培養(yǎng)液能夠促進(jìn)BMSCs增殖,且與PRP培養(yǎng)液濃度成負(fù)相關(guān)。BMSCs經(jīng)PRP培養(yǎng)液培養(yǎng)后,ALP染色及鈣結(jié)節(jié)染色呈陰性。PRP與誘導(dǎo)液聯(lián)合培養(yǎng)BMSCs,ALP染色陽(yáng)性率顯著提高。先行PRP培養(yǎng)液培養(yǎng)而后以成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)BMSCs明顯增加ALP染色陽(yáng)性率。單純高濃度PRP培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs表達(dá)ALP及OC減少,不同濃度PRP培養(yǎng)液加入誘導(dǎo)劑后,BMSCs表達(dá)ALP及OC明顯增加,

10、而且低濃度組增加更顯著。表明單純高濃度PRP培養(yǎng)液抑制BMSCs向成骨細(xì)胞分化,但不同濃度PRP均增強(qiáng)地塞米松對(duì)BMSCs的誘導(dǎo)作用,而低濃度PRP的此種作用更強(qiáng)。
　　 3、手術(shù)8周后,以PRP/BMSCs(經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo))復(fù)合物凝膠修復(fù)的兔顱骨缺損區(qū)有大量新骨形成,在整個(gè)骨缺損區(qū)分布均勻。以PRP/BMSCs(未經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo))復(fù)合物凝膠植入的骨缺損區(qū),新骨數(shù)量較少。單純PRP凝膠植入的骨缺損區(qū)新骨數(shù)量更少,分布不均,多

11、位于缺損區(qū)周邊。而以全血復(fù)合BMSCs植入的骨缺損區(qū),無(wú)論BMSCs是否經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo),其鏡下表現(xiàn)與空白對(duì)照組相似,未觀察到新形成的骨組織。
　　 結(jié)論：
　　 1、離心制備PRP時(shí),采用兩次離心法,每次離心力200g、離心時(shí)間10分鐘是制備PRP合適的方法。術(shù)前制備PRP在室溫條件存放12小時(shí)至36小時(shí)并未影響TGF-β1和PDGF釋放,是可行的。
　　 2、PRP培養(yǎng)液可促進(jìn)BMSCs增殖而以低濃度PRP

12、促進(jìn)BMSCs增殖更明顯。PRP不具有誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的功能,但能促進(jìn)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。并且這種促進(jìn)作用以低濃度PRP更強(qiáng),先行加入PRP培養(yǎng)液的效果更顯著。
　　 3、PRP凝膠有大量微孔,彼此互相交通,PRP復(fù)合經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的BMSCs可成功修復(fù)兔顱骨全層缺損,可以用作骨組織工程的支架。
　　 4、PRP在動(dòng)物體內(nèi)具有促進(jìn)新骨生成的能力,但誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的能力有限。當(dāng)采用P