復(fù)合富血小板血漿的可注射藻酸鹽組織工程骨的構(gòu)建和體外增殖、礦化的實驗研究.pdf

1、目的：觀察富血小板血漿(Platelet-Rich Plasma，PRP)，作為一種生長因子，在可注射藻酸鹽(Alginate，A)骨組織工程(Bone Tissue Engineering)中對成骨細(xì)胞(Osteoblasts，OBs)增殖及礦化功能的影響，探討可注射藻酸鹽骨組織工程復(fù)合富血小板血漿的可行性。 方法：①體外大鼠成骨細(xì)胞OBs的分離、培養(yǎng)及鑒定：取新生Wistar大鼠顱骨，采用多次酶消化法分離OBs，進(jìn)行體外培養(yǎng)

2、，Gomori鈣鉆法堿性磷酸酶染色和茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色鑒定OBs。②MTT法檢測細(xì)胞的增殖及活力：取第三代Wistar大鼠成骨細(xì)胞與1.5％藻酸鹽、富血小板血漿復(fù)合。實驗分三組，1.實驗組(成骨細(xì)胞/藻酸鹽/20％PKP)；2.對照組(成骨細(xì)胞/藻酸鹽)；3.成骨細(xì)胞貼壁生長組。體外連續(xù)培養(yǎng)14d，分別于培養(yǎng)的第2、3、4、5、6、7、10、12、14d，行MTT法檢測實驗組、對照組與貼壁生長細(xì)胞增殖能力，酶標(biāo)儀測定光密度值(OD值)，

3、每個樣本設(shè)三個復(fù)孔，求其平均值并繪制細(xì)胞生長曲線。③熒光四環(huán)素標(biāo)記法行礦化結(jié)節(jié)測定：取第三代Wistar大鼠成骨細(xì)胞，與1.5％藻酸鹽支架材料和富血小板血漿復(fù)合。實驗分三組，1.實驗組(成骨細(xì)胞/藻酸鹽/20％PRP)；2.對照組(成骨細(xì)胞/藻酸鹽)；3.成骨細(xì)胞貼壁生長組。在培養(yǎng)的第14d、24d、31d，對實驗組、對照組與單層培養(yǎng)組，行熒光四環(huán)素法標(biāo)記礦化結(jié)節(jié)，倒置熒光顯微鏡下觀察各組礦化情況，分別統(tǒng)計各組不同時間點的礦化結(jié)節(jié)數(shù)目、

4、礦化面積百分?jǐn)?shù)。 結(jié)果：①成骨細(xì)胞鑒定：Gomori鈣鈷法堿性磷酸酶染色后細(xì)胞呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，胞漿內(nèi)呈現(xiàn)灰黑色顆?；驂K狀沉淀；茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色后礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)深紅色，結(jié)節(jié)周圍細(xì)胞胞漿也呈紅染。②MTT法檢測細(xì)胞的增殖及活力：與單層培養(yǎng)相比，成骨細(xì)胞藻酸鹽三維培養(yǎng)未見明顯的細(xì)胞毒性，在培養(yǎng)周期內(nèi)細(xì)胞增殖一直呈上升趨勢。含20％PRP藻酸鹽三維培養(yǎng)組增殖能力明顯高于無PRP的三維培養(yǎng)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，尤其是培養(yǎng)的

5、第3-6d。③熒光四環(huán)素標(biāo)記法礦化結(jié)節(jié)測定：與單層培養(yǎng)相比，成骨細(xì)胞藻酸鹽三維培養(yǎng)的熒光強(qiáng)度、數(shù)目、體積，在培養(yǎng)周期內(nèi)隨培養(yǎng)時間延長而一直呈增多的趨勢。與對照組相比，含20％PRP實驗組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)目增多、礦化面積增大，組間各時間點的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：①成骨細(xì)胞的藻酸鹽三維培養(yǎng)體系，細(xì)胞代謝活性接近常規(guī)單層培養(yǎng)。 ②成骨細(xì)胞/藻酸鹽/PRP復(fù)合物，三者能很好的結(jié)合，均勻分布，三維培養(yǎng)下，能促進(jìn)成