間充質源性腫子細胞復合異體脫細胞軟骨構建軟骨組織的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 軟骨缺損一直是臨床工作的一大難題，自體軟骨來源少，異體軟骨吸收明顯，均限制了同種軟骨組織的應用，近年組織工程的研究發(fā)展為這一難題的解決帶來了新的機遇，大量軟骨組織工程的研究，帶動了人工軟骨時代的到來。本實驗體外誘導外周血源性間充質干細胞獲得軟骨種子細胞.分離異體兔肋軟骨獲取脫細胞軟骨，兩者共同培養(yǎng)以構建新型軟骨組織，為臨床修復器官缺損及再造提供實驗基礎。
　　 材料與方法：
　　 創(chuàng)建新西蘭兔創(chuàng)傷模

2、型，提取兔外周血間充質干細胞，體外行干細胞原代培養(yǎng)、傳代、凍存、復蘇及誘導分化成軟骨。體外誘導培養(yǎng)生長良好的第三代間充質干細胞14d獲得軟骨種子細胞，顯微鏡下觀察各期細胞生長特性及形態(tài)特征，制作種子細胞爬片行甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫細胞化學；聯(lián)合中性去垢劑-酶法獲得同種異體兔肋軟骨脫細胞支架，制備石蠟切片行HE染色、甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫細胞化學，鏡下觀察染色結果；制備掃描電鏡樣本，掃描電鏡下觀察支架形態(tài)與結構。自體間充質源性軟骨

3、種子細胞與異體脫細胞軟骨體外復合培養(yǎng)7d獲得復合軟骨，將復合軟骨植入自體實驗兔皮下，根據(jù)植入材料的差異分為A、B、C、D四組(A組：植入異體新鮮軟骨B組：植入脫細胞軟骨C組：植入復合軟骨D組：體外培養(yǎng)復合軟骨)，植入材料于植入后6w、12w取出，制備石蠟切片行HE染色、甲苯胺藍染色、MASSON染色，鏡下觀察染色結果；制備掃描電鏡樣本，掃描電鏡下觀察種子細胞與支架的生物相容性。
　　 結果：
　　 1.細胞形態(tài)學改變外周

4、血來源間充質干細胞培養(yǎng)3d-3.5d半量換液，可見少量細胞貼壁，呈短梭形或紡錘形，12-14d細胞已鋪滿皿底80-90％。1：2或1：3傳代后細胞生長迅速，呈長梭形或多角形，5-6d即可鋪滿皿底80％-90％。復蘇后第三代干細胞貼壁時間較凍存前延長，形態(tài)基本相同，呈長短梭形或多角形，5-7d即可傳代。外周血來源間充質干細胞體外誘導培養(yǎng)7d，較對照組生長明顯減慢，細胞團中央部分細胞呈類圓形或多角形，培養(yǎng)14d細胞增殖仍很緩慢，類圓形細胞逐

5、漸增多。對照組細胞出現(xiàn)明顯接觸抑制。甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色顯示：干細胞誘導14d，胞漿內有較多酸性黏多糖、軟骨細胞特異性Ⅱ型膠原基質分泌。
　　 2.脫細胞軟骨支架觀察兔脫細胞軟骨呈乳白色，結構完整、孔隙均勻，組織學染色、掃描電鏡觀察顯示起其仍保存大量酸性黏多糖及Ⅱ型膠原成分，其孔隙率為(61.31±8.45)％；孔徑長度為(32.80±5.15)μm。組織學染色及掃描電鏡觀察均顯示脫細胞軟骨具有良好的三維立體孔

6、徑結構。
　　 3.動物實驗結果種子細胞與脫細胞軟骨體外復合7d，初步獲得復合軟骨，掃描電鏡示支架與種子細胞黏附良好，細胞伸出偽足貼附于支架表面，并伴有多量基質分泌。將各組實驗材料植入兔背皮下后，6w、12w分別取出，各項觀察結果示：B、C組材料與生物體具有良好的相容性，C組材料在生物體內可逐漸降解吸收，并可形成少量乳白色類軟骨組織。
　　 結論：
　　 1.兔外周血來源廣泛，外周血間充質干細胞提取方便，體外生長

7、良好，具有良好的自我更新能力與分化潛能，是良好的軟骨組織工程種子細胞來源。第三代外周血間充質干細胞生長良好，適合行體外誘導培養(yǎng)成軟骨細胞。
　　 2.兔外周血間充質干細胞經(jīng)體外適宜條件下凍存及復蘇前后，其生物學活性未見明顯差異?？衫迷撎匦赃M行長期儲存，為后期應用提供支持。
　　 3.兔肋軟骨經(jīng)聯(lián)合中性去垢劑-酶法脫細胞處理，仍具有良好的三維立體空間構架、良好的基質構成、良好的孔徑長度及均勻的孔隙率，且與種子細胞具有良好