NO供體型樺木醇衍生物的合成及抗腫瘤機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　樺木醇(Betulin，BT)，一種重要的羽扇豆烷型三萜化合物，具有抗腫瘤、抗HIV、抗菌、抗炎等廣泛的藥理活性。但BT存在著水溶性低、藥效不顯著等問(wèn)題，限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，為了獲得具有良好抗腫瘤活性的BT衍生物，本研究對(duì)系列樺木醇NO供體衍生物進(jìn)行了合成，并研究了各衍生物體外NO釋放，選擇人肝癌細(xì)胞株Huh7和乳腺癌細(xì)胞株MCF-7評(píng)價(jià)化合物的增殖抑制作用，對(duì)潛在抗腫瘤作用衍生物的凋亡機(jī)制進(jìn)行探討。

2、　　方法:
　　采用酯化、親核取代、自由基取代等對(duì)BT的C-3、C-28或/和C-30進(jìn)行了修飾;Griess法測(cè)定了各衍生物體外NO釋放;MTT法及細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了樺木醇NO供體衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了樺木醇NO供體衍生物對(duì)細(xì)胞周期的影響及對(duì)線(xiàn)粒體膜電位的影響;免疫印跡技術(shù)檢測(cè)了對(duì)細(xì)胞周期蛋白（CDK1、CDC25C和CyclinB1）的表達(dá)

3、影響，對(duì)凋亡相關(guān)蛋白（Caspase3、Caspase9和PARP）的剪切情況;對(duì)線(xiàn)粒體調(diào)控蛋白(Bcl-2、Bax)及細(xì)胞色素c(Cyt c)釋放的作用;對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路表達(dá)改變的影響。
　　結(jié)果:
　　研究共合成7個(gè)NO供體的BT衍生物:3，28-二-[4-（2-硝氧基乙氧基）-1，4-丁二酰]-氧基樺木醇、3，28-二-[4-（4-硝氧基丁氧基）-1，4-順丁烯二酰]-氧基樺木醇、3，28-二-乙酰氧基-30

4、-硝氧基-樺木醇、3，28-二-{4-（8-硝氧-2，6-二氧二環(huán)[3.3.0]辛烷-4-氧）甲酰-苯甲酰氧基}-樺木醇、3，28-二-（2-硝氧基-乙酰氧基）-樺木醇、3，28-二-（2-硝氧基-丙酰氧基）-樺木醇、3，28-二-（2-硝氧基-異丁酰氧基）-樺木醇。所有的化合物均經(jīng)紅外光譜、核磁共振（1H-NMR和13C-NMR）等技術(shù)手段鑒定.各個(gè)BT衍生物的NO釋放情況各不相同，大多數(shù)衍生物的NO釋放量隨時(shí)間的變化改變不大，可較快

5、達(dá)到平衡狀態(tài)。其中，3，28-二-（2-硝氧基-乙?；?氧基樺木醇具有良好的抗腫瘤活性，并成功抑制Huh7、MCF-7腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，呈劑量依賴(lài)性。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法證實(shí)3，28-二-（2-硝氧基-乙酰氧基）-樺木醇誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡，通過(guò)調(diào)控Caspase家族蛋白通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。其中Caspase3與Caspase9表達(dá)減少，而C-Caspase3和C-Caspase9表達(dá)明顯增加。此外，3，28-二-（2-硝氧基-

6、乙酰氧基）-樺木醇可使Huh7細(xì)胞阻滯于G2/M周期。JC-1檢測(cè)到線(xiàn)粒體跨膜電位的損失，且JC-1單體的綠色熒光表達(dá)從3.48％增加到23.4％，說(shuō)明了化合物是通過(guò)線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并影響線(xiàn)粒體調(diào)控蛋白的表達(dá)。研究中發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，而B(niǎo)ax表達(dá)水平增加，Cyt c從線(xiàn)粒體中大量釋放。Western Blotting結(jié)果顯示，3，28-二-（2-硝氧基-乙酰氧基）-樺木醇呈劑量依賴(lài)性地顯著降低了PI3K催化亞基p1