類葉升麻苷對魚藤酮致shsy5y細胞凋亡的保護作用

1、hypertensive patients and 125 healthy volunteers . Sta2tistical analyses include one2 wayANOVA andχ2 analy2sis . Results The A rg16Gly and Gln27Glu poly mor2phis m s were in Hardy2 W einberg equilibrium. The al2lele freq

2、uency of 27Glu in the patients with hyperten2sion and obesity was 0. 069 and significantly higherthan that in the patients with hypertension and that inthe healthy volunteers ( P < 0105 ). Further studyshowed that thi

3、s association bet ween Gln27Glu poly2morphis m s and obesity existed only in male hyperten2sive patients, but not in females . Moreover, there wasno association bet weenβ 2 2 adrenoceptor haplotypes andobesity in our stu

4、dy . Conclusions These data suggestthat the Gln27Glu poly morphis m of β 2 2 adrenoceptorm ight be a major factor which contributes to obesitysusceptibility in male hypertensive subjects .Key words β 2 2 adrenoceptor; g

5、enetic poly morphis m;haplotypes; obesity; hypertension類葉升麻苷對魚藤酮致 SH2 SY5Y細胞凋亡的保護作用楊芳艷 , 蒲小平(北京大學藥學院分子與細胞藥理學系 ,北京 100083)中國圖書分類號 : R 282171; R 28411; R 329125; R 745170513文獻標識碼 : A 文章編號 : 1001 - 1978 (2006) 02 - 0159 -

6、06摘要 :目的 探討類葉升麻苷對魚藤酮致多巴胺能神經(jīng)元SH2 SY5Y細胞凋亡的保護作用及其機制。方法 采用 MTT法檢測細胞存活率 ,以熒光染料 Hoechst33342染色分析細胞核的形態(tài)學變化 ,用流式細胞儀定量分析細胞凋亡峰 ,以 2′ ,7′ 2 二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉 (DCFH2 DA )為標記探針檢測細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。結(jié)果 ①015μ mol·L- 1的魚藤酮處理 SH2 SY5Y細胞 48 h能

7、引起細胞存活率的顯著下降 ;誘導細胞發(fā)生凋亡 ,凋亡率達 47139%;大部分細胞胞體皺縮 ,突起縮短消失或斷裂 ;染色質(zhì)皺縮、 濃縮、 斷裂及形成凋亡小體 ;細胞內(nèi)活性氧水平上升。② 預先用鹽生肉蓯蓉提取物類葉升麻苷 (10, 20或 40 mg·L- 1 )處理細胞 6 h, 可提高細胞存活率 ;明顯改善魚藤酮引起的細胞形態(tài)學變化 ;流式細胞儀檢測凋亡率分別降低到 25187% , 23197% , 10145%;以DCF

8、H2 DA為標記探針檢測到 20 mg·L- 1類葉升麻苷可明顯抑制魚藤酮引起的細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生。 結(jié)論 類葉升麻苷能抑制魚藤酮誘導的多巴胺能神經(jīng)元 SH2 SY5Y細胞凋亡 ,其神經(jīng)細胞保護作用可能與降低細胞內(nèi)活性氧水平有關(guān)。關(guān)鍵詞 : 類葉升麻苷 ;魚藤酮 ;凋亡 ; SH2 SY5Y細胞 ;活性氧收稿日期 : 2005 - 09 - 12,修回日期 : 2005 - 11 - 18基金項目 : 國 家 重 點 基 礎

9、 研 究 發(fā) 展 計 劃 資 助 項 目 ( No2004CB519802) ; 國 家 自 然 科 學 基 金 資 助 項 目 ( No30472164)作者簡介 :楊芳艷 ( 1980 - ) ,女 ,碩士生 , Tel: 0102 87474980, E2 mail:elin569@ sohu . com;蒲小平 (1956 - ) ,女 ,博士 ,教授 ,博士生導師 ,通訊作者 ,研究方向 :帕金森病與細胞凋亡相關(guān)的分子機制及藥

10、物的干 預 作 用 , Tel: 0102 82802431, Fax: 0102 82802431, E2mail: puxiaoping@263. net帕金森病 (Parkinsons D isease, PD)是第二大最常見的神經(jīng)退行性疾病 ,它能選擇性和進行性地導致多巴胺能神經(jīng)元變性和壞死 ,并且在中腦黑質(zhì)神經(jīng)元的胞漿內(nèi)形成路易小體 (Lewy body) , 致使80%以上合成多巴胺的神經(jīng)元死亡 ,最終導致兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)

11、多巴胺的不足 ,并出現(xiàn) PD 特有的運動遲緩等癥狀。遺傳和環(huán)境因素在 PD 的發(fā)病中具有重要作用。神經(jīng)毒素如 12 甲基 2 42 苯基 2 1, 2, 3,62 四羥基吡啶 (12 methyl2 42 phenyl2 1, 2, 3, 62tetrahy2dropyridine, MPTP)或 62 羥基多巴胺 ( 62 hydroxydo2pam ine, 62 OHDA)制備的 PD 動物模型已應用了幾十年。然而 ,很少在 MP

12、TP和 62 OHDA制備的 PD動物模型的中腦黑質(zhì)神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn) Lewy body,它是PD發(fā)病后細胞漿內(nèi)特有的病理標志物。魚藤酮是一個從魚藤屬植物中提取的具有生物活性的廣譜殺蟲劑 ,也用于捕殺魚類。最近發(fā)現(xiàn)長期暴露于魚藤酮的大鼠可以出現(xiàn)類似 PD 生物化學、 解剖學和行為學癥狀等各方面的特征。最重要的是魚藤酮能誘導中腦黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生類似于路易小體的胞漿內(nèi)涵體[ 1, 2 ] 。因此 ,有人認為用魚藤酮制備的動物模型是研究 PD最好

13、的動物模型之一[ 3, 4 ] 。 同時 ,用魚藤酮處理細胞制備的 PD 細胞模型國內(nèi)外也有報道[ 5 ] ,有關(guān)鹽生肉蓯蓉 (Cistanche salsa)的有效成分類葉升麻苷對該細胞模型的保護作用尚未見國內(nèi)外報道。因此 ,本文就類葉升麻苷對魚藤酮致多巴胺能神經(jīng)元 SH2 SY5Y細胞凋亡的保護作用進行了探討和研究。1 材料和方法· 9 5 1 · 中國藥理學通報 Chinese Phar m acologi

14、cal B ulletin 2006 Feb; 22 (2) : 159～64(20 mg·L- 1 )組、 類葉升麻苷 (20 mg·L- 1 )單獨處理組、 活性氧陽性對照 (Rosup, 50 mg· L- 1 ,試劑盒提供 )組 1 × 106 細胞 ,懸浮于含 10μ mol·L- 1 2′ ,7′ 2 二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉 (DCFH2 DA ) 的無血清 DME M, 3

15、7 ℃, CO2 孵箱內(nèi)孵育 20 m in用無血清DME M洗 3次 ,以充分去除未進入細胞內(nèi)的 DCFH2DA。Rosup的濃度和作用時間均按照活性氧檢測試劑盒要求 ,終濃度 50 mg·L- 1 ,刺激細胞時間 30m in,用 FACScan流式細胞儀測定 DCF的平均熒光強度 ,激發(fā)光波長為 488 nm,發(fā)射波長為 525 nm,以各處理組 / 正常對照組的比值作為 ROS的數(shù)值。1. 2. 8 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學

16、分析 所有結(jié)果以 ? x ± s表示 ,應用 SPSS810軟件包 ,采用單因素方差分析及t檢驗分析處理數(shù)據(jù)。2 結(jié)果2. 1 類葉升麻苷對魚藤酮致 SH2 SY5Y細胞損傷的影響2. 1. 1 倒置顯微鏡下 SH2 SY5Y細胞的形態(tài)變化 正常對照組和類葉升麻苷單獨處理組 SH2 SY5Y細胞突起明顯 ,呈梭形、 不規(guī)則的三角形或多邊形。凋亡誘導組 SH2 SY5Y細胞大部分胞體皺縮 ,突起縮短消失或斷裂 ,細胞

17、呈圓形 ,而類葉升麻苷 (20 mg·L- 1 )組和 NGF (200 μg·L- 1 )組與凋亡誘導組比較 ,細胞胞體皺縮現(xiàn)象明顯改善 ,突起伸展 ,差異十分明顯 ( Fig 2)。2. 1. 2 Hoechst 33342核染色分析 正常對照組細胞的染色質(zhì)均勻分散于細胞核內(nèi)。凋亡誘導組可見部分細胞的染色質(zhì)出現(xiàn)典型凋亡樣改變 ,表現(xiàn)為染色質(zhì)呈月牙形聚集于核的一極 ,染色質(zhì)皺縮、 濃縮、斷裂、 形成凋亡小體 ;

18、而類葉升麻苷 (20 mg·L- 1 )組和 NGF組與凋亡誘導組比較 ,染色質(zhì)出現(xiàn)凋亡樣改變的細胞明顯減少 (Fig 3)。2. 1. 3 類葉升麻苷對魚藤酮致 SH2 SY5Y細胞存活率降低的影響 MTT法檢測發(fā)現(xiàn)魚藤酮作用 48 h后導致 SH2 SY5Y細胞的存活率下降到正常對照組細胞的 7717% ± 115%。類葉升麻苷單獨與細胞作用沒有引起毒性作用 ,而當類葉升麻苷 (10, 20, 40mg

19、83;L- 1 )預處理 6 h后 ,發(fā)現(xiàn)它能明顯抑制魚藤酮所導致的細胞存活率的下降 ,并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性 ,細胞存活率由模型組的的 7717% ± 115%分別增加 到的 8815% ±111% , 9719% ±110% ,10513% ± 117% (Tab 1)。陽性藥 NGF預處理 6 h,細胞存活率上升到 8310% ± 113%。以上結(jié)果表明 ,類葉升麻苷和 NGF可

20、明顯拮抗魚藤酮對 SH2SY5Y細胞的毒性作用。Tab 1 Effect of acteoside on rotenone2i nduced decreasei n SH2 SY5Y cell vi ability ( ? x ± s, n = 4)Treat ment MTT/% of controlControl 100. 0 ± 1. 8Rotenone 77. 7 ± 1. 5##Rotenone

21、+ 200μg·L - 1 NGF 83. 0 ± 1. 33 3Rotenone + 10 mg·L - 1 acteoside 88. 5 ± 1. 13 3Rotenone + 20 mg·L - 1 acteoside 97. 9 ± 1. 03 3Rotenone + 40 mg·L - 1 acteoside 105. 3 ± 1. 73 340

22、 mg·L - 1 acteoside 101. 4 ± 4. 6## P < 0101 vs control; 3 3 P < 0101 vs rotenone2. 1. 4 類葉升麻苷對魚藤酮致 SH2 SY5Y細胞凋亡的影響 細胞凋亡時 ,染色質(zhì) DNA降解、 斷裂成小分子量的片段并由細胞內(nèi)擴散出去而使細胞內(nèi)DNA含量降低 ,在 G 1 期前面出現(xiàn)一個 DNA含量減少的 G 1 亞峰 ( Su

23、b - G 1 peak) ,根據(jù)峰值的高低可以定量細胞凋亡的百分率。 PI染色法通過流式細胞儀可以檢測 G 1 亞峰來定量細胞凋亡的百分率。類葉升麻苷單獨處理組細胞凋亡率為 5154% (Fig 4) ,與正常對照組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義 ,提示40 mg·L- 1類葉升麻苷不會誘導 SH2 SY細胞凋亡。而 015μ mol·L- 1魚藤酮作用于 SH2 SY5Y細胞 48 h可誘導細胞凋亡 ,凋亡率從 61

24、24% (正常對照組 )升到 47139%。預先加入類葉升麻苷 (10, 20或者 40mg ·L- 1 )或者 NGF6 h后可明顯抑制細胞凋亡的Fig 2 Protective effect of acteoside on rotenone2i nduced morphological change i n SH2 SY5Y cells( × 200)A: control; B: treat mentwith 0

25、15μ mol·L - 1 rotenone; C: treat mentwith 015μ mol·L - 1 rotenone and 20 mg·L - 1 acteoside; D: treat mentwith015μ mol·L - 1 rotenone and 200μg·L - 1 NGF; E: treat ment with 20 mg·L - 1 acte