魚藤酮致PC12細(xì)胞凋亡中Par-4蛋白表達(dá)的改變.pdf

1、目的：帕金森病(Parkinson Disease，PD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床上以進(jìn)行性加重的運(yùn)動(dòng)緩慢、肌強(qiáng)直、靜止性震顫、姿勢(shì)步態(tài)異常等為特征，黑質(zhì)內(nèi)多巴胺(DA)能神經(jīng)元大量減少為基本的病理表現(xiàn)，機(jī)制目前尚不清楚，但普遍認(rèn)為與多種因素參與有關(guān)。生態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)常接觸工農(nóng)業(yè)毒物的人群PD患病率高[1]。因此，與魚藤酮等有關(guān)的環(huán)境因素是近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)。早期凋亡基因前列腺凋亡反應(yīng)蛋白(prostate apoptosis r

2、esponse-4,Par-4)改變發(fā)生在某些氧化應(yīng)激的損傷后，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的神經(jīng)元凋亡中具有關(guān)鍵作用。本研究旨在探討魚藤酮致多巴胺能神經(jīng)元凋亡中是否有Par-4表達(dá)的改變，為PD的基因治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。 方法：1、5、10μmol/L的魚藤酮作用于PC12細(xì)胞6h和24h，采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性，存活率=(實(shí)驗(yàn)孔OD490值-空白對(duì)照孔OD490值)/(正常對(duì)照孔OD490值-空白孔OD490值)×100％

3、； PI染色法通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western Blot檢測(cè)Par-4表達(dá)量的改變；篩選出Par-4表達(dá)改變明顯的魚藤酮濃度和作用時(shí)間給予信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，同樣采用Western Blot檢測(cè)Par-4表達(dá)量的改變，確定Par-4改變是通過(guò)哪條信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。 結(jié)果：1.PC12細(xì)胞受毒6h時(shí)，各濃度組細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有顯著改變，24h后，10μmol/L組細(xì)胞不同程度的皺縮，胞體變小，亮度增強(qiáng)，胞體的細(xì)小突起消失。 2.細(xì)

4、胞存活率檢測(cè)：魚藤酮作用6h后，1、5、10μmol/L組的存活率依次降低至93％、90％、90％，且各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。24h后，加藥各組的存活率依次降低至87％、78％、54％，且各組之間存活率也有顯著差異(P＜0.05)。 3.凋亡檢測(cè)：1、5、10μmol/L魚藤酮作用6h，各組沒(méi)有明顯的凋亡峰。24h后，10μmol/L組出現(xiàn)了不典型的凋亡峰，凋亡率為11％。其他各組未出現(xiàn)凋亡峰。 4.魚藤酮作用后Par-4

5、的改變： 魚藤酮作用于PCI2細(xì)胞后6h，1、5μmol/L組的光密度比值與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而10μmol/L組光密度比值顯著升高(p=0.029646)；作用24h后，1μmnol/L(p=0.018461)和5μmol/L(p=0.043415)兩組光密度比值均升高，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而10μmol/L(p=0.081298)在與對(duì)照組比較則差異消失了。同濃度下不同時(shí)間的Par-4表達(dá)量也有不同。如1μm

6、ol/L(p=0.006308)和5μmol/L(p=0.034624)組在24h時(shí)比6h時(shí)光密度比值顯著升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而10μmol/L組24h光密度比值反而低于6h組(p=0.023487)。 5.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑應(yīng)用后Par-4改變：c-Jun氨基端激酶(JNK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑Ginestin 20μmol/L預(yù)處理PC12細(xì)胞1h，再加入魚藤酮處理，結(jié)果顯示10μmol/L魚藤酮作用6h后，Par-4/acti

7、n比值沒(méi)有顯著升高，與單純魚藤酮作用組比較，顯著降低(p=0.0131)，而與正常對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.59475).其他通路抑制劑作用組與單純魚藤酮作用組比較，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： 1.魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡中有Par-4凋亡蛋白的表達(dá)升高。 2.Par-4表達(dá)升高具有時(shí)間和濃度依賴性。 3.Par-4表達(dá)升高是一過(guò)性，且時(shí)間有限。 4.JNK參與魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Par-4表