人JNK3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)SHSY5Y細(xì)胞系的建立.pdf

1、凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞自主性、程序性死亡。在機(jī)體的生命活動(dòng)中，細(xì)胞凋亡和抗凋亡呈現(xiàn)出統(tǒng)一的動(dòng)態(tài)平衡，其間各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和信號(hào)分子之間存在著復(fù)雜關(guān)系，調(diào)控著細(xì)胞的生存和死亡。研究表明，細(xì)胞的凋亡和抗凋亡失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNKs）為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）超家族成員之一?，F(xiàn)已證明M

2、APK通路可轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)，而JNK信號(hào)通路則在其中起著十分重要的作用。 在脊椎動(dòng)物，JNK由jnk1、jnk2、jnk3三種基因編碼，表達(dá)的JNK1、JNK2、JNK3蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。這3種基因編碼的蛋白產(chǎn)物可通過(guò)選擇性剪接產(chǎn)生了10種轉(zhuǎn)錄本。JNK1和JNK2在全身各組織廣泛表達(dá)，JNK3僅在腦、心臟、睪丸等組織特異表達(dá)。和JNK1、JNK2不同，只有JNK3具有一個(gè)含38個(gè)氨基酸殘基的

3、延長(zhǎng)的N末端特殊區(qū)域?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，JNK3與神經(jīng)退行性病變、神經(jīng)細(xì)胞的增殖和凋亡有密切聯(lián)系，可促進(jìn)缺血、缺氧和有毒化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)JNK3與腫瘤之間關(guān)系的研究尚不明確。因此，本課題應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建人JNK3真核表達(dá)載體，再穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤（SHSY5Y）細(xì)胞，分析其JNK3的表達(dá)，并探討JNK3與腫瘤細(xì)胞凋亡的聯(lián)系，為深入研究JNK3的功能奠定基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容主要包括以下兩個(gè)部分： 一、JN

4、K3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定。方法：以pDBLeu-JNK3為模板，PCR擴(kuò)增獲得人JNK3基因全長(zhǎng)，目的片段定向插入至真核表達(dá)載體pEGFP-C3中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)抗生素平板篩選獲得陽(yáng)性克隆，再分別進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定。結(jié)果：獲得了長(zhǎng)為1269bp的人JNK3編碼區(qū)全長(zhǎng)DNA片段，并成功地將其定向插入到真核表達(dá)載體pEGFP-C3的CMV啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成為包含人JNK3基因的重組質(zhì)粒pEGFP-C3-JNK3，PCR和酶切

5、鑒定證實(shí)該重組質(zhì)粒帶有JNK3目的基因片段，DNA測(cè)序確認(rèn)插入片段的序列準(zhǔn)確無(wú)誤。結(jié)論：真核表達(dá)載體pEGFP-C3-JNK3構(gòu)建成功。 二、穩(wěn)定表達(dá)人JNK3的SHSY5Y細(xì)胞系的建立及其在細(xì)胞凋亡方面的研究。方法：通過(guò)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人JNK3的SHSY5Y細(xì)胞系。熒光顯微鏡下觀察重組綠色熒光蛋白的表達(dá)，并采用RT-PCR、Western

6、 blot檢測(cè)JNK3的表達(dá)。以過(guò)氧化氫（H2O2）為促凋亡因素，MMT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞系的細(xì)胞增殖及凋亡情況。結(jié)果：經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和G418抗性篩選6～8周，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-JNK3質(zhì)粒的SHSY5Y細(xì)胞系。在該細(xì)胞系中JNK3基因能被有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，且在H2O2誘導(dǎo)下，JNK3可明顯抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。結(jié)論：穩(wěn)定表達(dá)人JNK3的SHSY5Y細(xì)胞系建立成功。在H2O2誘導(dǎo)下，JNK3可明顯抑制細(xì)胞增殖及促