酶法不對(duì)稱合成(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基已酸叔丁酯.pdf

1、(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯(AST-7)是合成降血脂藥物阿托伐他汀鈣的關(guān)鍵手性砌塊。生物催化制備手性化合物是目前公認(rèn)的綠色環(huán)保高效的制備技術(shù)。本文設(shè)計(jì)了ATS-7合成新路線，以6-氰基-3，5-二羰基己酸叔丁酯(CDOH)為初始底物，采用兩步酶法不對(duì)稱還原生成ATS-7，具有重要研究意義。主要內(nèi)容如下:
　　1.以不對(duì)稱還原CDOH生成(5R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯(ATS-6)為模式反應(yīng)

2、，采用基因挖掘的策略，構(gòu)建了包含八種羰基還原酶的酶庫，但均末檢測到不對(duì)稱還原CDOH的催化活性;
　　2.以不對(duì)稱還原ATS-6生成ATS-7為模式反應(yīng)，采用基因挖掘的策略，構(gòu)建了包含六種醛酮還原酶的酶庫。醛酮還原酶SCAKR，PKAKR，CGAKR，KMAKR，NCAKR，ZBAKR實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)，其中醛酮還原酶SCAKR對(duì)ATS-6具有較高的催化活性，酶活為672U/L;
　　3.研究了醛酮還原酶SCAKR的酶學(xué)性質(zhì)，

3、其分子量大小約為38kDa，在pH7.0，25℃時(shí)活性最高且保持較好穩(wěn)定性。SCAKR不對(duì)稱還原ATS-6的Km值為32.04mM，vmax值為1.99U/mg，kcat值為0.259s-1。經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化和搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化后酶活達(dá)到1281U/L;
　　4.由于不對(duì)稱還原ATS-6時(shí)需要輔酶NADPH輔酶的參與，因此選擇葡萄糖脫氫酶為輔酶再生酶構(gòu)建了再生體系，綜合考慮成本和催化效率，確定重組菌E.coli BL21(DE3)/pE