Curcumin通過(guò)增強(qiáng)Rab7表達(dá)促進(jìn)自噬體的軸突運(yùn)輸.pdf

1、目的：
　　阿爾茨海默?。ˋD）是一種起病隱匿的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病。自噬作為一種真核細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解途徑，與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。自噬體大量堆積在軸突末端不能與溶酶體結(jié)合不僅影響了Aβ的代謝，更容易引起自噬應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。Rab7是一種小GTP酶，在自噬體的成熟以及自噬體與溶酶體的融合中都發(fā)揮著重要作用。研究表明，curcumin（姜黃素）作為一種多酚類植物化合物，在AD中起神經(jīng)保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚有待進(jìn)

2、一步研究。本研究擬通過(guò)體外研究的方法，首先驗(yàn)證curcumin減少Aβ的沉積以及對(duì)AD的神經(jīng)保護(hù)作用；再觀察curcumin對(duì)自噬及自噬流的影響；緊接著進(jìn)一步研究其對(duì)自噬體軸突運(yùn)輸?shù)淖饔茫蛔詈筇接懫渥饔脵C(jī)制是否與Rab7的表達(dá)有關(guān)。本研究選擇一個(gè)新的視角探討curcumin對(duì)AD的作用機(jī)制，為AD的治療提供新的靶點(diǎn)、新的思路。
　　方法：
　　首先將細(xì)胞分為4組：WT組（N2a/WT細(xì)胞）、Control組（N2a/APP6

3、95swe細(xì)胞）、Sham組（經(jīng)5μM DMSO溶液處理24h的N2a/APP695swe細(xì)胞）、Curcumin組（經(jīng)5μM curcumin溶液處理24h的N2a/APP695swe細(xì)胞）。流式細(xì)胞術(shù)用于檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率和線粒體膜電位的變化。ELISA實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中Aβ的表達(dá)。通過(guò)透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步觀察各組細(xì)胞中自噬體及自噬溶酶體數(shù)量的變化，并運(yùn)用Western Blot檢測(cè)LC3II、SQSTM1、B

4、eclin1、Atg7、Atg16L1、Dynein、KIF3B以及Rab7的表達(dá)。qRT-PCR用于檢測(cè) Rab7在分子水平的表達(dá)。然后進(jìn)一步在 N2a/APP695swe細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、pcDNA3.1-Rab7、NC-siRNA、Rab7-siRNA后，將細(xì)胞分為5組：Control組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-Rab7組、NC-siRNA組、Rab7-siRNA組，再次用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組中細(xì)胞凋亡率和線

5、粒體膜電位的變化，ELISA檢測(cè)各組中Aβ的表達(dá)，透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察各組細(xì)胞中自噬體及自噬溶酶體數(shù)量的變化，Western Blot檢測(cè)LC3II、SQSTM1、Dynein、KIF3B蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　與Control組相比，經(jīng)curcumin處理細(xì)胞24h后，細(xì)胞凋亡率明顯降低（P=0.000），線粒體膜電位升高（P=0.000），細(xì)胞上清液中Aβ的含量減少（P=0.000）；透射電鏡和激光共

6、聚焦顯微鏡均顯示自噬體增加，且自噬溶酶體數(shù)量也增加；Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LC3II、Beclin1、Atg7、Atg16L1、Dynein以及Rab7的表達(dá)均增多（P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.003；P=0.000；P=0.000），而SQSTM1和KIF3B的表達(dá)降低（P=0.000；P=0.000）；qRT-PCR結(jié)果顯示Rab7在mRNA水平表達(dá)也有所增加（P=0.000）。在N2a/APP

7、695swe細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Rab7過(guò)表達(dá)載體后，與Control組相比，細(xì)胞凋亡率降低（P=0.000），線粒體膜電位增加（P=0.000），細(xì)胞上清液中Aβ的含量減少（P=0.000）；透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示自噬體和自噬溶酶體數(shù)量也增加；Western Blot結(jié)果表明雖然LC3II的表達(dá)無(wú)明顯差異（P=0.865），但SQSTM1表達(dá)明顯減少（P=0.000），Dynein和KIF3B的表達(dá)有所增加（P=0.000；P=0.