薯蕷皂苷經(jīng)5-LO-LTB4信號通路治療RA的作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分薯蕷皂苷經(jīng)5-LO/LTB4途徑對TNF-α誘導(dǎo)FLS損傷的保護(hù)作用及機(jī)制
　　研究背景和目的：
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜異常增生為主要特征的自身免疫疾病?；ぎ惓Ｔ錾c滑膜細(xì)胞的凋亡和增殖失衡有關(guān)，其中成纖維樣滑膜細(xì)胞（Fibroblast-like synoviocytes,FLS）作為血管翳形成的主要細(xì)胞，由于凋亡不足積極參與RA的進(jìn)程。RA患者FLS的

2、特征是呈腫瘤樣擴(kuò)張，在血管翳形成、軟骨和骨侵蝕中具有中心作用。腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor alpha,TNF-α）產(chǎn)生于RA免疫反應(yīng)的早期，能夠誘導(dǎo)體內(nèi)很多細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（Interleukin6, IL-6）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）、白細(xì)胞介素-8（Interle

3、ukin8,IL-8）、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase2,COX-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMP）等，促進(jìn)滑膜增生，參與RA等炎癥免疫反應(yīng)。薯蕷皂苷（Dioscin,Dio）具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗腫瘤、抗血小板聚集等多種藥理作用，表明了其廣闊的應(yīng)用前景。本實驗我們采取TNF-α體

4、外誘導(dǎo)FLS作為RA的離體模型，探索Dio對TNF-α誘導(dǎo)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型（CollagenⅡinduced arthritis,CIA）大鼠FLS（RAFLS）的治療作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　1.將0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml TNF-α與RAFLS共同孵育24h、48h、72h，MTT法檢測

5、細(xì)胞存活率，確定TNF-α誘導(dǎo)RAFLS的最佳濃度和時間。
　　2.將0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml Dio與TNF-α誘導(dǎo)的RAFLS共同孵育24h、48h、72h檢測細(xì)胞存活率，確定Dio對TNF-α誘導(dǎo)RAFLS作用的合適濃度和時間。
　　3. ELISA檢測對照組、TNF-α模型組、Dio1

6、μg/ml組、Dio2μg/ml組、Dio3μg/ml組、Dio4μg/ml組細(xì)胞培養(yǎng)上清中白三烯B4（Leukotriene B4,LTB4）含量的變化。
　　4.實時熒光定量PCR（Real-time Quantitative transcription polymerase chain reaction, Q-PCR）檢測對照組、TNF-α模型組、Dio1μg/ml組、Dio2μg/ml組、Dio3μg/ml組、Dio4μg

7、/ml組細(xì)胞中5-脂氧酶（5-lipoxygenase,5-LO）、白三烯A4水解酶（Leukotriene A4 hydrolase,LTA4H）、白三烯B4受體1（Leukotriene B4 receptor1,BLT1）、白三烯B4受體2（Leukotriene B4 receptor1,BLT2） mRNA的表達(dá)變化。
　　5.蛋白印跡檢測對照組、TNF-α模型組、Dio1μg/ml組、Dio2μg/ml組、Dio3μg

8、/ml組、Dio4μg/ml組細(xì)胞中5-LO、LTA4H蛋白的表達(dá)變化。
　　6.免疫熒光檢測對照組、TNF-α模型組、Dio1μg/ml組、Dio2μg/ml組、Dio3μg/ml組、Dio4μg/ml組細(xì)胞中LTA4H蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.與對照組相比，2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml劑量組TNF-α與RAFLS共同孵育24h、48h、72h均能顯著提高細(xì)胞的存活率，且

9、10ng/ml劑量組TNF-α處理組RAFLS增殖促進(jìn)作用最為明顯（P＜0.05）。綜合考慮，以后的實驗我們選用終濃度為10ng/ml TNF-α處理24h制作細(xì)胞模型。
　　2.與TNF-α模型組相比，1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml劑量組Dio能夠時間劑量依賴性的抑制TNF-α誘導(dǎo)的RAFLS的增殖（P＜0.05）。3μ

10、g/ml劑量組Dio作用于RAFLS24h后，細(xì)胞存活率達(dá)到49.46±1.33，接近50％。綜合考慮，后續(xù)實驗我們選用1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml劑量組Dio處理TNF-α誘導(dǎo)的RAFLS，作用24h。
　　3.與對照組相比，RAFLS經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后，培養(yǎng)上清中LTB4含量明顯升高，Dio能劑量依賴的降低TNF-α引起的LTB4含量的升高（P＜0.05）。
　　4.與對照組相比，RAFLS經(jīng)T

11、NF-α誘導(dǎo)后，細(xì)胞中5-LO和LTA4H mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。與TNF-α模型組相比，1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml Dio劑量組細(xì)胞5-LO和LTA4H mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。
　　5.與對照組相比，RAFLS經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后，細(xì)胞中BLT1和BLT2 mRNA表達(dá)明顯升高，1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml劑量組Dio能顯著降低TNF-α模型細(xì)胞中

12、BLT1和BLT2 mRNA表達(dá)，4μg/ml劑量組Dio能顯著降低FLS中BLT2 mRNA表達(dá)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.10ng/ml TNF-α與RAFLS共同孵育24h，可以顯著促進(jìn)RAFLS的增殖，故選擇此濃度作用24小時制作離體RA疾病模型。
　　2.1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml的Dio與TNF-α誘導(dǎo)的RAFLS共同孵育24h，能顯著抑制RAFLS細(xì)胞的增殖，提示其

13、對TNF-α引起的RAFLS損傷具有保護(hù)作用。
　　3.Dio可以降低TNF-α誘導(dǎo)的RAFLS培養(yǎng)上清中LTB4的含量，這可能與其對FLS損傷的保護(hù)作用有關(guān)。
　　4.Dio可能通過下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的RAFLS中LTB4合成酶系5-LO和LTA4H表達(dá)，降低上清中LTB4的含量。
　　5.Dio可以降低TNF-α誘導(dǎo)的RAFLS LTB4受體BLT1和BLT2的表達(dá)，阻礙LTB4下游通路，發(fā)揮對TNF-α誘導(dǎo)的RA

14、FLS損傷的治療作用。
　　第二部分薯蕷皂苷經(jīng)5-LO/LTB4途徑治療CIA小鼠的作用及機(jī)制
　　研究背景和目的：
　　RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特征的常見的自身免疫病。臨床患者表現(xiàn)為關(guān)節(jié)晨僵、腫脹、畸形，甚至功能喪失、殘疾等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。CIA模型是與RA臨床發(fā)病最為相似的動物模型，是RA實驗研究的常用動物模型。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為薯蕷皂苷具有“消食利水，舒筋活血，祛痰，截瘧”的功效，現(xiàn)代研究證實薯蕷皂苷具有調(diào)

15、節(jié)免疫、抗炎、抗腫瘤、改善心血管功等多種藥理作用，是一種潛在的治療RA的中藥。本實驗擬應(yīng)用牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的CIA小鼠模型，從整體動物水平研究薯蕷皂苷片（Dioscornin tablets,DT）對RA的治療作用，并探討其分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.雄性昆明系小鼠（6-8周齡），體重25±2g，隨機(jī)分為對照組、CIA小鼠模型組和DT5個劑量組：15.6 mg/（kg·d）、31.2 mg/（kg·d）、62.4 mg/（

16、kg·d）、124.8mg/（kg·d）、249.6 mg/（kg·d），每組12只。于初次免疫d21，對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，用藥組給予不同劑量的DT灌胃，觀察DT對CIA模型小鼠體重、關(guān)節(jié)指數(shù)、足爪腫脹程度、胸腺和脾臟指數(shù)、脾臟和滑膜病理損傷的影響。
　　2.ELISA檢測對照組，CIA模型組，低、中、高DT組小鼠血清中LTB4含量變化。
　　3.反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測對照組，CIA模型組，低、中、高D

17、T組小鼠脾臟中5-LO、LTA4H、BLT1、BLT2 mRNA表達(dá)的變化。
　　4.蛋白印跡和免疫組化檢測對照組，CIA模型組，低、中、高DT組小鼠脾臟中5-LO、LTA4H蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.與對照組相比，CIA模型組小鼠體重、關(guān)節(jié)指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹度以及胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯高于對照組（P＜0.05）。與CIA模型組相比，灌胃治療12天后31.2 mg/（kg·d）、62.4 mg/（kg·d）、1

18、24.8mg/（kg·d）DT劑量組小鼠體重、關(guān)節(jié)指數(shù)和關(guān)節(jié)腫脹度有不同程度的降低，灌胃治療21天后小鼠的脾臟指數(shù)均不同程度的降低（P＜0.05）。灌胃治療21天后62.4 mg/（kg·d）各DT劑量組小鼠胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.05），脾臟病理損傷和踝關(guān)節(jié)病理損傷明顯改善。
　　2.與對照組相比，CIA模型組小鼠血清中LTB4的含量明顯升高，而不同劑量組DT均能顯著的降低CIA小鼠血清中LTB4含量（P＜0.05）。

19、　　3.與對照組相比，CIA模型組小鼠脾臟中LTA4H和5-LO mRNA和蛋白的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），而DT低、中、高組劑量均能顯著的降低CIA小鼠脾臟中5-LO和LTA4H蛋白的表達(dá)，DT低、中組劑量能顯著的降低CIA小鼠脾臟中5-LO mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。
　　4.與對照組相比，CIA模型組小鼠脾臟中BLT1和BLT2 mRNA表達(dá)明顯升高，DT低、中組劑量能顯著的降低CIA小鼠脾臟中BLT1 mRNA表

20、達(dá)，低、中、高劑量DT均能顯著降低CIA小鼠脾臟中BLT2 mRNA表達(dá)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．31.2 mg/（kg·d）、62.4 mg/（kg·d）、124.8mg/（kg·d）劑量組DT可明顯降低CIA小鼠體重、關(guān)節(jié)指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹度以及胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，并且可明顯改善小鼠胸腺和脾臟病理損傷，因此對CIA小鼠有治療作用。
　　2.CIA模型組小鼠血清中LTB4的含量明顯升高，不同劑量組DT均可顯