化學發(fā)光及其與毛細管電泳聯用技術的應用研究.pdf

1、化學發(fā)光(CL)是化學反應的反應物或生成物吸收了反應釋放的化學能，電子由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，再由激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時所產生的光輻射，它不需要任何光源，避免了雜散光的干擾，因此具有極高的靈敏度。由于僅使用較為簡單的儀器設備，這一方法得到了迅速發(fā)展。目前，化學發(fā)光分析成為一個非?；钴S的研究領域，已成功地用于生產過程的控制、遙測技術、環(huán)境污染自動檢測網絡系統(tǒng)的建立、生物醫(yī)學及臨床化學中各種無機和有機化合物的分析、藥物分析和免疫分析等。其最新發(fā)展主要

2、是在原有的發(fā)光試劑及體系的基礎上，建立新的發(fā)光體系。與其它技術如流動注射(FIA)、毛細管電泳(CE)、高效液相色譜(HPLC)等的聯用，拓寬了化學發(fā)光的應用范圍。 毛細管電泳(CE)是以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型分離分析技術，在20世紀80年代中后期得到迅速發(fā)展。毛細管電泳實際包含電泳、色譜及其交叉內容，被譽為繼氣相色譜和液相色譜之后分離科學的第三次重大變革，使分析科學得以從微升水平進入納升水平，并使單細胞

3、，乃至單分子分析成為可能。最富特色的應用研究有蛋白質分離、糖分析、DNA測序、手性分離、單細胞分析以及用于分子動力學及疾病早期診斷等，此外金屬離子及小分子有機化合物的毛細管電泳分析也備受關注。毛細管電泳中窄徑毛細管的使用，使CE具有很低的質量檢出限和僅需要很少的樣品體積等優(yōu)點，但同時窄的內徑也給檢測帶來了困難，使其濃度靈敏度很低。最近，靈敏度的限制已成為毛細管電泳發(fā)展的一大障礙，改善檢測靈敏度也已成為毛細管電泳一個十分重要的研究領域。

4、 高靈敏度的化學發(fā)光檢測手段與高選擇性的毛細管電泳結合于一體，成為一種理想的分離分析方法，兩種方法能取長補短，充分發(fā)揮各自優(yōu)勢，非常適合復雜中草藥有效成分的分析。可以說，毛細管電泳化學發(fā)光法的聯用技術為現代痕量分析帶來勃勃生機，開辟了高靈敏分析中草藥中多羥基酚類化合物的新途徑。 本論文首先對已建立的發(fā)光體系靈敏度的改善和新建立的化學發(fā)光體系進行了深入系統(tǒng)的研究，建立了流動注射化學發(fā)光法測定人體體液和動物血液中的一些成分以及

5、四環(huán)素類藥物的方法。其次，為了改善化學發(fā)光較差的選擇性和毛細管電泳較低的靈敏度，將兩種技術聯用，運用自組裝的改進后的毛細管電泳化學發(fā)光分析儀，用于分析中草藥中有效成分-多羥基酚類化合物。由于毛細管很容易再生，毛細管電泳化學發(fā)光法成為分析復雜樣品的一種理想方法。 一、流動注射化學發(fā)光1.研究發(fā)現，陽離子表面活性劑CTMAB對魯米諾-鐵氰化鉀-亞鐵氰化鉀體系分析尿酸的含量有很強的增敏作用，并且尿酸的形態(tài)對發(fā)光強度也有很大的影響?；?/p>

6、此，采用流動注射技術，建立了測定人體體液中尿酸含量的方法。該方法的線性范圍和檢出限分別是7.0×10-9-9.0×10-7mol/L，2.58×10-10mol/L，與文獻報道的其它方法相比，檢出限降低約兩個數量級。并詳細討論了CTMAB對該體系增敏及尿酸的形態(tài)對發(fā)光強度影響的機理。 2.氯化血紅素的光穩(wěn)定性較差，利用H2O2-Na2CO3-NaOH介質，首次使用流動注射-化學發(fā)光技術，對氯化血紅素在強自然光、弱自然光及紫外光作

7、用下分解情況進行了研究，分析了光解反應的動力學規(guī)律，結果發(fā)現氯化血紅素在不同光作用下的分解反應速度不同，但其光解行為符合一級反應方程。優(yōu)化反應條件后，測定了藥物和動物血液中氯化血紅素的含量，線性范圍為2.20×10-10-6.88×10-7mol/L，檢出限(3σ)為2.2×10-11mol/L。對1.72×10-9mol/L的氯化血紅素測定10次的相對標準偏差為2.82％。此法直接用于藥物及動物血液中氯化血紅素含量的分析，回收率在96

8、-108％之間。 3.堿性條件下，羅丹明B與過氧化氫反應產生微弱化學發(fā)光信號，氯化血紅素作為一種過氧化物酶，大大增強了其化學發(fā)光強度。當加入處于臨界膠束濃度的陰離子表面活性劑SDS后，其發(fā)光強度又增大了4倍多。同時對加入SDS和不加入SDS的氯化血紅素樣品在紫外光下的光解行為進行研究，發(fā)現兩種情況下，氯化血紅素的分解行為均符合一級動力學方程。但是，加入SDS后，由于其形成的膠束相的增穩(wěn)作用，氯化血紅素的光解速度降低了1.8倍。該

9、方法用于測定了藥片及動物血液中氯化血紅素的含量。 4.對于四環(huán)素類藥物的化學發(fā)光分析報道的方法中，有的方法反應比較復雜，有的方法使用的試劑比較昂貴、不穩(wěn)定或者有毒性。本研究首次使用間接發(fā)光法，以銅離子為探針，利用四環(huán)素類藥物與銅離子形成絡合物后，減弱了銅離子對魯米諾-過氧化氫體系的催化作用機理，分析了藥物及其人體尿液中四環(huán)素、土霉素和金霉素的含量。方法的線性范圍分別是四環(huán)素3.6×10-8-1.0×10-5，土霉素1.1×10-

10、7-1.0×10-5，金霉素1.9×10-7-1.0×10-5mol/L。藥物中的賦形劑和尿液中的共存物不干擾測定，方法的回收率為95-105％。 二、毛細管電泳化學發(fā)光1.運用改進后的毛細管電泳化學發(fā)光儀，以魯米諾為電泳電解質的一個組成部分及以鐵氰化鉀作為唯一柱后液的新型混合模式進行丹參的主要成分原兒茶醛和原兒茶酸的毛細管電泳化學發(fā)光法研究，結果發(fā)現原兒茶醛和原兒茶酸能增強體系的發(fā)光強度，且發(fā)光強度與其濃度在一定范圍內成正比。

11、詳細研究了影響分離和檢測的參數，在最佳條件下，6分鐘內基線分離了原兒茶醛和原兒茶酸。方法的檢出限分別為7.0×10-8mol/L和5.0×10-8mol/L。利用此方法，分析了丹參片劑和注射液中原兒茶醛和原兒茶酸的含量。對二者增強魯米諾-鐵氰化鉀體系發(fā)光強度的機理進行了詳細討論。 2.蘆丁和綠原酸均為生理學上重要的多羥基酚類化合物，也是煙草中的重要成分。本工作將毛細管區(qū)帶電泳分離化學發(fā)光檢測應用于蘆丁與綠原酸的分析。CL檢測基于

12、蘆丁或綠原酸對魯米諾-鐵氰化鉀發(fā)光體系的增敏作用。仔細研究了分離與檢測的各種參數后，將此方法用于香煙絲和藥物制劑中蘆丁與綠原酸含量的測定，回收率在97-105％之間。 3.利用SDS作為有機添加劑，首次報道了應用CE-CL技術分析蘆丁、原兒茶醛、綠原酸、木犀草素和原兒茶酸5種藥物有效成分。實驗表明，不加入SDS時，5種分析物不能得到完全分離；SDS加入后，5種分析物在10分鐘內得到完全基線分離，且峰形尖銳對稱。分析物峰高的RSD

13、不大于2.6％，遷移時間的RSD不大于0.5％。將建立的方法應用于實際樣品的測定，回收率在95-105％之間。該方法具有分離效果好、檢測靈敏度高等特點，為復雜中草藥中有機小分子的分析開辟了新的途徑。 4.基于在堿性介質中葡萄糖苷和黃芩苷對魯米諾-鐵氰化鉀化學發(fā)光體系的抑制作用，建立了一種毛細管區(qū)帶電泳分離在線間接化學發(fā)光法檢測中藥有效成分葡萄糖苷和黃芩苷的方法。電泳緩沖液為8.0mmol/L硼砂(pH=8.5)，0.30mmol

14、/L魯米諾作為其中的組分?；瘜W發(fā)光試劑由0.125mmol/LK3Fe(CN)6和0.05mol/L的NaOH組成。葡萄糖苷和黃芩苷在5分鐘內得到基線分離。方法的檢出限分別為60fmol和24fmol。該方法用于雙黃連口服液中黃芩苷的測定，回收率為103.3％。 5-溶液中單分子檢測涉及到化學、生物、醫(yī)學、材料等多個學科領域，對其進行研究具有十分重要的意義，目前對有機小分子的分子級檢測尚未見報道。我們研究了小分子有機化合物棉酚的