裂殖壺菌高產(chǎn)DHA的發(fā)酵技術(shù)研究及其代謝機(jī)理分析.pdf

1、DHA（Docosahexaenoic acid，二十二碳六烯酸）是含有六個(gè)雙鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸，屬于ω-3系列的。經(jīng)過(guò)多年研究發(fā)現(xiàn)，DHA對(duì)人體的多種生理活動(dòng)具有十分重要的調(diào)控和促進(jìn)作用，DHA是人視網(wǎng)膜細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)組織中必需的主要成分之一，尤其對(duì)嬰幼兒大腦和視力發(fā)育方面起到非常重要的促進(jìn)作用。裂殖壺菌（Schizochytrium），作為一種大型的海洋真菌，因?yàn)槠渖L(zhǎng)快、油脂含量高，被廣泛的應(yīng)用于DHA油脂的生產(chǎn)研究中。但是，利用裂殖

2、壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA油脂過(guò)程中，存在培養(yǎng)基鹽離子濃度高，DHA含量偏低，生產(chǎn)成本過(guò)高等問(wèn)題，從而嚴(yán)重制約著該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
　　該論文以本實(shí)驗(yàn)室具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的裂殖壺菌S056（Schizochytrium sp. S056）為出發(fā)菌株，建立了低成本、高強(qiáng)度DHA油脂的清潔生產(chǎn)新技術(shù)，揭示了DHA大量合成的代謝機(jī)理，并通過(guò)對(duì)DHA中試條件的優(yōu)化及放大規(guī)律的研究，在10噸規(guī)模發(fā)酵罐上成功實(shí)現(xiàn)了DHA油脂的工業(yè)化生產(chǎn)。該研究解決了傳統(tǒng)培

3、養(yǎng)基中高鹽的問(wèn)題，并突破了DHA含量大幅提升的瓶頸，顯著提高了DHA含量和產(chǎn)品品質(zhì)，具體研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下：
　?。?）建立了一種低鹽發(fā)酵新技術(shù)，顯著降低了培養(yǎng)基中的鹽離子濃度。海水晶（NaCl）是裂殖壺菌發(fā)酵過(guò)程中為了模擬海水環(huán)境必須添加的培養(yǎng)基組分，但高濃度海鹽的存在，增加了發(fā)酵廢水的處理難度，且大量氯離子的存在對(duì)發(fā)酵罐腐蝕嚴(yán)重，增加了固定資產(chǎn)投入等。針對(duì)以上問(wèn)題，本研究通過(guò)對(duì)海水晶在裂殖壺菌發(fā)酵過(guò)程中的生理作用開(kāi)展了詳細(xì)研究

4、分析，發(fā)現(xiàn)滲透壓的改變對(duì)裂殖壺菌S056的生長(zhǎng)影響極小，且裂殖壺菌S056培養(yǎng)基中的高濃度海水晶（20 g/L）可被低濃度的硫酸鈉（2-10 g/L）完全替換。該技術(shù)的建立顯著降低了培養(yǎng)基中鹽離子的濃度，使發(fā)酵廢水的處理難度下降明顯，也徹底解決了氯離子對(duì)發(fā)酵罐的腐蝕問(wèn)題，降低了DHA生產(chǎn)的原料成本和固定資產(chǎn)投入成本。
　?。?）建立了高含量DHA油脂發(fā)酵新技術(shù)，顯著提高了DHA含量，初步揭示了DHA合成與初級(jí)代謝相關(guān)性。為了進(jìn)一步

5、提高裂殖壺菌所產(chǎn)油脂中 DHA含量，本文針對(duì)影響油脂大量合成的關(guān)鍵因素進(jìn)行了詳細(xì)分析，并對(duì)可影響DHA積累的發(fā)酵碳源開(kāi)展了詳細(xì)研究，通過(guò)甘油對(duì)葡萄糖的替換，DHA含量顯著提高，由葡萄糖培養(yǎng)的39.68％提高到甘油培養(yǎng)時(shí)的52.28%，增幅達(dá)31.75%。進(jìn)一步對(duì)甘油和葡萄糖參與裂殖壺菌的初級(jí)代謝途徑中的關(guān)鍵酶及關(guān)鍵代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)甘油對(duì)菌體內(nèi)的磷酸戊糖路徑中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）有明顯的抑制作用，進(jìn)而降低了菌體內(nèi)的還

6、原型輔酶II（NADPH）含量，DHA的合成量并沒(méi)有因NADPH的下降而下降，表明裂殖壺菌S056體內(nèi)DHA的合成路徑不止一條。
　?。?）基于比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)，對(duì)甘油和葡萄糖兩種碳源培養(yǎng)條件下的差異基因的表達(dá)進(jìn)行全面分析，成功揭示了甘油促進(jìn)DHA大量合成機(jī)理。與葡萄糖發(fā)酵相比，甘油培養(yǎng)時(shí)，裂殖壺菌S056體內(nèi)的糖異生路徑和磷酸戊糖路徑路徑均被明顯抑制，而與乙酰輔酶A合成相關(guān)的代謝路徑，包括糖酵解和支鏈氨基酸（Valine, Leuc

7、ine and isoLeucine）代謝路徑均明顯增強(qiáng)。此外，甘油也顯著抑制了三羧酸循環(huán)路徑（TCA cycle），致使更多的乙酰輔酶A向油脂合成路徑轉(zhuǎn)化，顯著促進(jìn)傳統(tǒng)脂肪酸合成路徑（fatty acid synthesis system，F(xiàn)AS system）的關(guān)鍵酶基因FAS基因表達(dá)量增強(qiáng)，使DHA含量得以大幅提高。該研究對(duì)促進(jìn) DHA大量合成的調(diào)控提供了重要的理論指導(dǎo)。
　　（4）建立了高品質(zhì)DHA油脂的中試培養(yǎng)技術(shù)，并實(shí)

8、現(xiàn)了該技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用。本研究基于以上研究成果，首先對(duì)影響DHA合成的關(guān)鍵因素—溶氧和溫度開(kāi)展詳細(xì)研究，在100 L規(guī)模發(fā)酵罐上建立了分段溶氧控制和恒溫培養(yǎng)策略；其次，根據(jù)裂殖壺菌S056在100 L發(fā)酵罐上甘油的動(dòng)態(tài)消耗曲線，在不延長(zhǎng)發(fā)酵周期的前提條件下，確定了最佳補(bǔ)料方案，最終獲取的油脂中DHA含量高達(dá)52.61%，DHA產(chǎn)量達(dá)23.40 g/L，顯著提高了 DHA產(chǎn)量和生產(chǎn)效率；最后，以攪拌功率相等的準(zhǔn)則為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)裂殖壺菌S05

9、6的放大規(guī)律進(jìn)行探索，通過(guò)對(duì)1000 L發(fā)酵罐中裂殖壺菌S056培養(yǎng)過(guò)程中的溶氧濃度進(jìn)行調(diào)整，使其與100 L發(fā)酵罐上的溶氧濃度保持一致，從而很好的實(shí)現(xiàn)裂殖壺菌S056在1000 L發(fā)酵罐上的高密度培養(yǎng)，并將該放大規(guī)律在10噸發(fā)酵罐上進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，DHA產(chǎn)量平均在22 g/L以上，且油脂中DHA的含量維持在50%以上，在10噸規(guī)模發(fā)酵罐成功實(shí)現(xiàn)了高品質(zhì)DHA的高強(qiáng)度發(fā)酵生產(chǎn)。
　　綜上所述，本文實(shí)現(xiàn)了裂殖壺菌的低鹽培養(yǎng)，顯著