裂殖壺菌培養(yǎng)基優(yōu)化、菌種選育及遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究.pdf

1、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是一種n-3多不飽和脂肪酸。自上世紀(jì)Dyerberg發(fā)現(xiàn)DHA對(duì)心血管病等有重要作用以來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)DHA在嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、保護(hù)視力、抗癌、抗炎等方面也有重要的作用。裂殖壺菌(Aurantiochytrium limacinum)作為一種理想的工業(yè)化DHA生產(chǎn)菌,其DHA含量可達(dá)到細(xì)胞干重的40％左右,近年來(lái)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。本論文從培養(yǎng)條件優(yōu)化、菌種選育、

2、功能基因克隆以及轉(zhuǎn)基因方法等方面對(duì)裂殖壺菌開(kāi)展研究,為提高裂殖壺菌的生物量和DHA含量奠定基礎(chǔ)。
　　本文以裂殖壺菌Aurantiochytrium limacinum為研究對(duì)象,以MnCl2·4H2O, ZnSO4·7H2O,CoCl2?6H2O為三個(gè)因子,探討了微量元素對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)及DHA含量的影響。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示裂殖壺菌的生物量與DHA含量呈正相關(guān)關(guān)系, Co2+對(duì)裂殖壺菌的生物量及DHA含量影響最大,其次是Zn2+和M

3、n2+。正交實(shí)驗(yàn)的理論最優(yōu)組合與實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合一致,為MnCl2·4H2O:32mg/L;ZnSO47H2O:30mg/L;CoCl2·6H2O:1.2mg/L。在添加了微量元素的裂殖壺菌配方中,裂殖壺菌生物量提高了61.38%,DHA含量提高了47.85%。
　　然后,本文以裂殖壺菌Aurantiochytrium limacinum OUC168為出發(fā)菌株,經(jīng)亞硝基胍誘變及喹禾靈篩選,篩選出性狀優(yōu)良的突變菌株 Aurantioc

4、hytrium limacinum OUCB1。該菌株的生物量達(dá)到7.33 g·L-1·d-1,比出發(fā)菌株提高65.09%;DHA含量達(dá)到18.05%,提高49.92%。以菌株、培養(yǎng)基中葡萄糖、谷氨酸鈉、酵母提取物含量這四個(gè)因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn),測(cè)定不同菌株在不同培養(yǎng)條件下生物量、DHA含量和乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)活性并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示,生物量、DHA含量和ACCase活性受培養(yǎng)基各成分變化的影響較小,而與菌株因素關(guān)系密切

5、,ACCase活性與生物量、DHA含量存在正相關(guān)關(guān)系。同時(shí)我們得到了突變株OUCB1的最佳培養(yǎng)條件:葡萄糖70 g/L、谷氨酸鈉20 g/L、酵母提取物20 g/L。突變株OUCB1的經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)于出發(fā)菌株,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　聚酮合酶(PKS)是裂殖壺菌多不飽和脂肪酸合成的一個(gè)關(guān)建酶,在DHA合成途徑中起著尤為關(guān)鍵的作用。本文克隆得到了pks2的基因全長(zhǎng),共6105bp,不含有內(nèi)含子。這6105個(gè)堿基編碼一個(gè)完整的蛋白,含2

6、034個(gè)氨基酸,其氨基酸序列共包含4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,分別是KS,AT和FabD酶域,其中KS酶域在氨基酸序列上重復(fù)出現(xiàn),但是2個(gè)KS酶域并不相同,可能與催化不同的反應(yīng)底物有關(guān)。同時(shí)我們?cè)诹阎硥鼐邪l(fā)現(xiàn)了FAS合成途徑中的FabD酶域,他與PKS合成途徑中的AT酶域功能大體一致。本研究首次克隆得到裂殖壺菌pks2基因全長(zhǎng),為從分子水平研究裂殖壺菌的DHA合成途徑奠定了基礎(chǔ),并為裂殖壺菌的基因改造提供了有用的基因信息。
　　最后,我們將

7、Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)應(yīng)用到了裂殖壺菌中,將含有l(wèi)oxP位點(diǎn)、氯霉素標(biāo)記和綠色熒光蛋白的p18SCPGC載體轉(zhuǎn)入裂殖壺菌OUC168中,得到能在含有氯霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的且能夠發(fā)出綠色熒光的裂殖壺菌OUC_EG。通過(guò)再次轉(zhuǎn)入pSH65質(zhì)粒,利用pSH65質(zhì)粒Cre重組酶的作用將loxP位點(diǎn)中間的氯霉素標(biāo)記基因切除,得到?jīng)]有抗生素抗性,但是仍能發(fā)出綠色熒光的裂殖壺菌OUC_CG。通過(guò)PCR檢測(cè)驗(yàn)證了裂殖壺菌OUC_CG中氯霉素標(biāo)