裂殖壺菌培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化及PKS酶域過表達菌株的構建.pdf

1、裂殖壺菌（Aurantiochytrium limacinum）又稱裂壺藻，是一種海洋真菌，細胞內含有大量的油脂，其中二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，簡稱DHA）含量最多。DHA是一種是重要的n-3多不飽和脂肪酸，能促進嬰幼兒大腦和視網膜的發(fā)育及成熟，并且對老年人降低血脂、預防心血管疾病等有明顯作用。由于裂殖壺菌容易培養(yǎng)，生長速度快，并且細胞內的DHA含量高等優(yōu)點，成為微生物發(fā)酵生產DHA的優(yōu)良菌種。本論文從裂

2、殖壺菌培養(yǎng)基中氮源的優(yōu)化、聚酮合酶(PKS)基因的克隆以及轉化等方面進行研究，為降低裂殖壺菌生產DHA的成本，提高裂殖壺菌生物量、DHA含量奠定基礎。
　　實驗室前期成功實現了豆粕水解物做裂殖壺菌發(fā)酵中的氮源，替代了酵母提取物，降低了生產成本，但是豆粕水解液的制備需要酸解，易腐蝕設備，而且操作繁瑣。因此迫切要求尋找適宜的廉價氮源以滿足工業(yè)生產的要求。本研究以裂殖壺菌Aurantiochytrium limacinum OUC168

3、為實驗菌株，首次以玉米漿干粉做氮源進行培養(yǎng)實驗，結果裂殖壺菌在以酵母提取物(20g/L)做氮源的培養(yǎng)基上生物量為4.40 g/L·d，DHA含量是8.95％;在玉米漿干粉(20g/L)做氮源的培養(yǎng)基上生物量是4.13g/L·d，DHA含量是8.72％，由于玉米漿干粉的價格是酵母提取物的十分之一，在生物量和DHA含量差幅不大的情況下，大大降低了發(fā)酵生產的成本，對工業(yè)化生產有重要意義。進一步以玉米漿干粉、谷氨酸鈉、葡萄糖這三個因素設計正交試

4、驗，結果葡萄糖120g/L、玉米漿干粉15g/L、谷氨酸鈉20g/L得到了最高的生物量和DHA含量，分別為5.48 g/L·d和12.50％，為以后的發(fā)酵生產提供了理論基礎。
　　聚酮合酶(PKS)是裂殖壺菌合成多不飽和脂肪酸的一個關鍵酶，本研究采用Genome walking方法，克隆得到了完整的pks1(4386bp)基因序列。并首次克隆得到了含有CAAT-box和TATA-box等啟動子元件的pks1基因的啟動子序列。為從分

5、子水平研究和改造裂殖壺菌來提高DHA的合成奠定了基礎。
　　將本研究中獲得的pks1序列與實驗室前期獲得的pks2序列進行比對，發(fā)現在2991bp-4386bp處序列相似性很高，達78％，該序列經BLAST比對屬于丙二酰轉移酶酶域，具有將丙二酸單酰-CoA裝載到?；d體蛋白(ACP)的功能，該序列在兩段pks基因中都存在，推測其在DHA合成中具有重要作用，因此本研究將該序列構建同源重組載體p18SCPGC-1，轉化裂殖壺菌，使其在

6、裂殖壺菌中過量表達。通過對轉化菌株進行細胞形態(tài)、生長曲線、生物量及DHA含量的性狀分析，結果顯示轉化菌株生物量為5.02g/L·d，比未轉化菌株提高14.6％，轉化菌株的DHA含量是17.11％，比未轉化菌株提高37.90％。
　　本文首次成功使用玉米漿干粉作為氮源來培養(yǎng)裂殖壺菌，為降低生產成本，提高裂殖壺菌的工業(yè)化生產水平提供了實驗依據;對pks1基因的克隆分析及構建酶域過表達菌株為研究DHA合成過程中相關酶的功能，并為基因工程