β-雙酮類抗生素暴露斑馬魚F1差異miRNA的篩選及其功能研究.pdf

1、背景：
　　β-雙酮類抗生素（β-diketone antibiotics, DKAs）是當(dāng)前產(chǎn)量與使用量最大的藥物種類。被廣泛使用在人類及動(dòng)物疾病的預(yù)防與治療，畜牧養(yǎng)殖業(yè)等方面。人畜服用此類藥物大多不能被完全吸收，多以活性代謝物形式進(jìn)入環(huán)境，雖然半衰期短，但連續(xù)頻繁的使用造成“假持久”現(xiàn)象，嚴(yán)重危害生態(tài)環(huán)境和人類健康。miRNA通過靶向降解mRNA或抑制mRNA的翻譯參與個(gè)體的發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生理調(diào)控過程。目前，mi

2、RNA的調(diào)控作用成為毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)，但少有學(xué)者從miRNA分子調(diào)控上系統(tǒng)地研究DKAs致毒的分子機(jī)理。因此，本研究利用新一代高通量illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)，通過現(xiàn)代分子生物學(xué)結(jié)合病理組織觀察的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，深入而系統(tǒng)地探討DKAs暴露致毒的分子機(jī)理，正確評(píng)價(jià)其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，該研究對(duì)污染性疾病的預(yù)防、治療和干預(yù)具有重要的指導(dǎo)意義。
　　目的：
　　本研究借助新一代高通量illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)完成DKAs暴露

3、斑馬魚F1的miRNAs測(cè)序，構(gòu)建差異文庫，篩選出陽性差異miRNAs并預(yù)測(cè)其差異調(diào)控靶基因，明確其調(diào)控靶基因的功能及其涉及的信號(hào)代謝通路。然后通過qRT-PCR和W-ISH或ISH等技術(shù)驗(yàn)證候選miRNAs的表達(dá)變化，以及其異常表達(dá)造成的毒性效應(yīng)與功能損傷，揭示DKAs對(duì)子一代斑馬魚致毒的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.設(shè)置濃度梯度的DKAs自6 hpf胚胎持續(xù)暴露至斑馬魚性成熟，收集F1代7 dpf幼魚進(jìn)行高通量illu

4、mina MiSeq測(cè)序。然后對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選出一批符合標(biāo)準(zhǔn)的、高豐度陽性差異（p≤0.05,100≤FPKM≤110000） miRNAs。用在線軟件DIANA miRPath(v.2.0)預(yù)測(cè)其可能調(diào)控的靶標(biāo)基因（P＜0.05）并繪制信號(hào)通路富集熱區(qū)圖，明確其涉及的代謝通路和作用的功能系統(tǒng)。用Cytoscape軟件繪制miRNAs與靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　2.利用qRT-PCR驗(yàn)證DKAs處理下候選的高豐度陽性

5、差異miRNAs的差異表達(dá)變化模式。然后通過原位雜交技術(shù)來探究其在親本生殖器官和F1幼魚中的時(shí)空表達(dá)部位和變化模式，結(jié)合HE染色和透射電鏡結(jié)果分析其異常變化對(duì)生殖器官的病理組織損傷。
　　3.運(yùn)用油紅O染色對(duì)F1幼魚整體和親本成魚肝臟冰凍切片進(jìn)行脂肪代謝紊亂的研究，同時(shí)利用脂質(zhì)測(cè)定試劑盒檢測(cè)斑馬魚親本血清和F1代幼魚體內(nèi)的甘油三酯和總膽固醇的含量變化。
　　4.進(jìn)一步篩選出miR-144和miR-125b調(diào)控脂肪代謝相關(guān)靶基

6、因，體外合成miR-144和miR-125b激動(dòng)劑和抑制劑，利用顯微注射技術(shù)，有針對(duì)性地展開其調(diào)控脂肪代謝方面的功能確證。
　　結(jié)果：
　　1.高通量illumina MiSeq測(cè)序產(chǎn)生的valid reads分別為8.14×106（Control）、8.69×106（6.25 mg/L）、10.57×106（12.5 mg/L）的數(shù)據(jù)量，共獲得193條陽性差異miRNAs。經(jīng)生物學(xué)信息分析獲得11條高豐度陽性差異miRNA

7、s并預(yù)測(cè)其差異靶基因的功能主要富集在癌癥調(diào)節(jié)、信號(hào)和能量傳導(dǎo)及脂肪酸代謝等通路上。
　　2.候選的11條miRNAs qRT-PCR結(jié)果顯示70％左右的miRNAs表達(dá)變化趨勢(shì)與測(cè)序數(shù)據(jù)相一致。原位雜交結(jié)果顯示：miR-125b、miR-430c在親本卵巢組織中及miR-124、miR-499在F1幼魚中的表達(dá)隨著暴露濃度的提高其表達(dá)強(qiáng)度也增加，呈現(xiàn)濃度梯度依賴關(guān)系。miR-124、miR-499主要分布在幼魚的肝臟、腦、鰓、泄殖

8、腔等部位。
　　3. HE染色和透射電鏡（TEM）結(jié)果顯示DKAs處理可誘導(dǎo)斑馬魚成魚卵巢過早衰老、組織發(fā)生損傷，嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞的發(fā)育與成熟。油紅O染色顯示DKAs暴露顯著影響斑馬魚親本和F1代體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，主要表現(xiàn)脂肪粒堆積，脂質(zhì)含量升高、肝功能異常，提示可能誘發(fā)肥胖癥的發(fā)生。
　　4.外源性miRNA激動(dòng)劑和抑制劑的干預(yù)成功改變幼魚體內(nèi)的miR-144和miR-125b水平，引起了調(diào)控靶基因的異常表達(dá)，而miRNA

9、及靶基因變化引發(fā)的肝臟脂肪代謝異常和靶基因的功能有待于進(jìn)一步深入。
　　結(jié)論：
　　利用新一代illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)完成了DKAs長期暴露斑馬魚的F1代幼魚miRNAs組學(xué)測(cè)序，共獲得193條陽性差異miRNAs。經(jīng)生物學(xué)信息分析獲得11條高豐度陽性差異miRNAs并預(yù)測(cè)其差異靶基因的功能主要富集在癌癥調(diào)節(jié)、信號(hào)和能量傳導(dǎo)及脂肪酸代謝等通路上。通過qRT-PCR、原位雜交技術(shù)驗(yàn)證了一批候選miRNAs在親