基因重組大腸桿菌以不同碳源合成L-苯丙氨酸的比較.pdf

1、L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine，L-Phe)是人體的一種必需氨基酸，對人體具有重要的作用。目前，由于甜味劑阿斯巴甜(aspartame，AMP)、氨基酸類抗癌藥物及營養(yǎng)保健品的生產(chǎn)和應用，使L-Phe的市場需求量大大增加。但是國內(nèi)僅有的幾個L-Phe的生產(chǎn)企業(yè)，規(guī)模都比較小，產(chǎn)酸率也只有8％左右，靠國內(nèi)生產(chǎn)的L-Phe不能滿足市場需求，所以國內(nèi)應用的L-Phe主要靠進口。為促進以L-苯丙氨酸為原料的產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和降低我國的經(jīng)

2、濟負擔，大力開發(fā)和完善L-苯丙氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)技術和工藝，實現(xiàn)規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)，是十分有必要的。
　　 目的
　　 1.以大腸桿菌MG1655為宿主菌，將含有相同質粒的營養(yǎng)缺陷型菌株在分別以甘油、葡萄糖、甘油和葡萄糖的混合物為碳源的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，比較不同碳源對細菌生長及L-Phe產(chǎn)量的影響。
　　 2.將不同質粒分別在野生型菌株和營養(yǎng)缺陷型菌株中表達，并在同等條件下進行發(fā)酵。在發(fā)酵結束時，比較不同質粒在兩種菌株中

3、的生長情況和L-Phe的產(chǎn)量差別，篩檢出高產(chǎn)菌株。
　　 方法：
　　 1.采用λ-Red重組的方法將野生型MG1655染色體上的pheL、pheA、tyrA和aroF四個基因敲除，獲得營養(yǎng)缺陷型菌株MG1655△aroF。
　　 2.通過定點突變和multiplex PCR等技術，以pZE12為載體構建不同的基因型質粒。
　　 3.將基因重組和野生型菌株分別在以甘油、葡萄糖、甘油和葡萄糖混合液(甘油和葡

4、萄糖以質量比3:2的比例混合)為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測發(fā)酵過程中分別由pheA、aroF和aroG編碼的蛋白酶的表達情況。將蛋白酶高表達的菌株進行發(fā)酵。
　　 4.發(fā)酵過程中，用薄板層析法粗測L-Phe的產(chǎn)量；發(fā)酵結束后，用氨基酸自動分析儀測定發(fā)酵液中游離L-Phe的含量。
　　 結果：
　　 1.同一基因型大腸桿菌分別在以葡萄糖、甘油、甘油與葡萄糖混合物

5、為碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵。結果顯示細菌在葡萄糖中生長最慢，在混合培養(yǎng)基中進入對數(shù)期較晚，L-Phe在甘油中的產(chǎn)量高于在葡萄糖和混合碳源中的產(chǎn)量，最高可達兩倍。
　　 2.將本實驗中所構建的6個基因型分別在營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌菌株和野生型菌株中表達，并在甘油中發(fā)酵。結果顯示在pheA和aroG串聯(lián)表達的基因型中，pZE12pheAfbraroGM(pZE12AfbrGM)合成L-Phe的能力最強，而pZE12pheAaroG(pZE12

6、AG)的最弱；在pheA和aroF串聯(lián)表達的基因型中，pZE12pheAfbraroF(pZE12AfbrF)合成L-Phe的能力大于pZE12pheAaroF(pZE12AF)。同一個基因型質粒在MG1655中的生長速度比在MG1655△aroF中快，但是在MG1655中的L-Phe產(chǎn)量低于MG1655△aroF。
　　 結論：
　　 1.pZE12AFMG△ aroF、pZE12AfbrFMG△ aroF、pZE12