耐酸和耐熱蘇氨酸菌株構(gòu)建.pdf

1、L-蘇氨酸是人體必需氨基酸之一，是構(gòu)成蛋白的重要組成部分，廣泛應(yīng)用于食品、飼料和醫(yī)療等方面。大腸桿菌發(fā)酵過程中，維持較低的pH和較高的發(fā)酵溫度，可以節(jié)約流加的液氨和冷卻水用量。若發(fā)酵液在較低pH時(shí)放罐，對于濃縮、等電結(jié)晶工藝來講，可以節(jié)省中和所用的硫酸。因此，發(fā)酵過程pH和溫度的控制有利于降低氨基酸生產(chǎn)過程中的能源消耗。
　　本文對大腸桿菌耐酸系統(tǒng)(ARs)進(jìn)行分子改造，使大腸桿菌在酸性環(huán)境生存下來;對HSP20小熱激蛋白、四氫嘧

2、啶合成途徑的引入，可以較大程度提高了大腸桿菌的耐熱性能;從而使L-蘇氨酸高產(chǎn)菌E.coli THRD在低pH、高溫條件下有更高的L-蘇氨酸產(chǎn)量。
　　以L-蘇氨酸高產(chǎn)菌THRD為出發(fā)菌株，利用大腸桿菌的AR2或AR3耐酸系統(tǒng)進(jìn)行分子改造，構(gòu)建菌株THRD（pTrc99a-gadBC）、THRD araABD∷gadBC、THRD(pTrc99a-LGOX)、THRD（pTrc99a-arcA）、THRD araABD∷arcA。對

3、耐酸改造菌株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，在5L分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中，發(fā)酵初始pH7.0，在發(fā)酵前中期維持pH7.0，在發(fā)酵后期24 h左右，停止流加氨水，pH降到6.0以前不調(diào)節(jié)pH。pH降到6.0之后，維持pH6.0發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，THRD(pTrc99a)產(chǎn)量達(dá)到100±1 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率32.9％; THRD(pTrc99a-gadBC)、THRD(pTrc99a-arcA)、THRD(pTrc99a-LGOX)的L-蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到106±

4、2 g/L、115±3 g/L、110±2 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到34.7％、36.9％、36.5％，相較于THRD(pTrc99a)的產(chǎn)量和菌體糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高了分別提高了6.0％、15.0％、10.0％和5.6％、12.3％、10.9％。THRD araABD∷gadBC、THRD araABD∷arcA菌株發(fā)酵12h后，生物量增長速率、L-蘇氨酸的生成速率明顯減低，菌株增長緩慢。幾株耐酸改造蘇氨酸生產(chǎn)菌，發(fā)酵結(jié)果顯示，AR2耐酸

5、系統(tǒng)和AR3耐酸系統(tǒng)的改造有利于在酸性條件發(fā)酵L-蘇氨酸的高產(chǎn)。
　　以L-蘇氨酸高產(chǎn)菌THRD為出發(fā)菌株，對耐熱因子進(jìn)行分子改造，構(gòu)建菌株THRD(p Trc99a-ectABC)、THRD（pBV220-hsp20）。對耐熱改造菌株，在5L分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中，發(fā)酵初始溫度37℃，在發(fā)酵前中期維持溫度37℃，在發(fā)酵12 h-14h左右，OD600(30-35)，調(diào)整溫度為40℃，維持溫度40℃發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，THRD(pBV2

6、20-hsp20)蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到129 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到37.1％，相較于THRD(pBV220)菌株的L-蘇氨酸產(chǎn)量和菌體糖酸轉(zhuǎn)化率較原菌分別提高了7.5％和6.9％;THRD（pTrc99a-ectABC）的生物量是15.58 g DCW/L，THRD(pTrc99a)的生物量是11.97 g DCW/L。THRD（pTrc99a-ectABC）蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到125 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到40.3％，相較于THRD(pTrc9