催化合成茶氨酸的菌株篩選與重組菌的構建.pdf

1、茶氨酸(Theanine)是1950年首次從綠茶中分離得到的，是茶葉中的特征氨基酸，也是茶葉的呈味物質之一，具有很好的生理功能和商業(yè)價值。其制備研究是目前茶學研究中的一個熱點。由于從茶葉中提取高純度的茶氨酸，成本高昂；化學合成茶氨酸工藝較復雜；組織培養(yǎng)合成茶氨酸產量低。開展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理論意義和實踐價值。本論文針對茶氨酸的微生物發(fā)酵法制備技術，開展了菌株篩選和工程菌構建兩方面工作，將生物技術運用到天然產物制備技術中。本

2、論文通過比較不同微生物催化L-谷氨酰胺(L-Gln)和鹽酸乙胺合成茶氨酸的能力大小，對微生物進行了篩選，明確了9種微生物催化合成茶氨酸的能力；通過基因克隆技術構建了重組菌，優(yōu)化了重組菌催化合成茶氨酸的條件，重組菌株酶活達到出發(fā)菌株的15倍，茶氨酸產量達到29.40g/L。主要研究結果如下： 1、對9種微生物催化L-谷氨酰胺和鹽酸乙胺合成茶氨酸的能力進行了測試，發(fā)現(xiàn)它們催化合成茶氨酸的能力都很低。茶氨酸的最大生成量僅為7.9mg/

3、L。 2、以培養(yǎng)好的EscherichiacoliDH5α(E.coliDH5α)菌液為模板進行PCR反應，將擴增出的γ-谷氨酰轉肽酶基因片斷和載體pET-32a相連接構建重組質粒pET-GGT，將重組質粒pET-GGT轉化至E.coliBL21中，構建重組菌。重組菌株經0.05mMIPTG在32℃誘導后，SDS-PAGE結果顯示出明顯的特征蛋白質條帶。經酶活性檢測，重組菌株每克濕菌體的酶活達到2.0U/ml左右，約是出發(fā)菌株E

4、.coliDH5α的15倍。 3、本實驗優(yōu)化了重組菌催化L-谷氨酰胺和鹽酸乙胺合成茶氨酸的反應條件，重組菌經37℃培養(yǎng)2h左右，然后再加IPTG至0.05mM于32℃誘導表達4h收集菌體。1ml反應體系(含0.35ML—谷氨酰胺、2.0M鹽酸乙胺、70mg/ml菌體、pH9.5)于30℃培養(yǎng)4小時，茶氨酸的最大生成量為29.40g/L，即每克濕菌體可催化合成茶氨酸的量為420g/L。L-Gln轉化率為48.22％。Suzuki等

5、報道的用構建的重組菌催化谷氨酰胺(Gln)和乙胺合成茶氨酸的量為20.90g/L，Gln轉化率為60％。本實驗中的L-Gln轉化率稍低，但是茶氨酸產量有所提高。 本實驗構建的重組菌具有較好的催化L—谷氨酰胺和鹽酸乙胺合成茶氨酸的能力，可以嘗試用其進行發(fā)酵生產茶氨酸小試實驗，可以嘗試將本實驗構建的重組質粒轉化到不同表達載體系統(tǒng)中，以尋找更適合γ-谷氨酰轉肽酶大量表達的載體系統(tǒng)。本實驗對于微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產茶氨酸等方面的工作具有