利用非糧原料生產(chǎn)乙醇工藝及工程菌的研究.pdf

1、生物乙醇吸引越來越多的關注和應用，主要原因是它作為可再生液體交通燃料，既可緩解石油能源危機，也可減少溫室氣體排放。生物乙醇即可以單獨或與汽油混配制成乙醇汽油作為汽車燃料。生物乙醇燃料燃燒所排放的二氧化碳(CO2)約等于生產(chǎn)乙醇所用生物質吸收的CO2，CO2凈排放等于零。生物乙醇可用不同類型的可再生原料采用微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)，第1代原料-甘蔗、玉米、小麥、木薯和甜高粱等，第2代原料-木質纖維素生物質，第3代原料-藻類生物質。針對木薯乙醇和

2、纖維素乙醇中存在的問題，我們從三個角度進行研究和改進工藝或菌種:1）通過采用和優(yōu)化降粘酶來完成木薯濃醪發(fā)酵;2)基于CO2固定構建可高效代謝木糖的工程釀酒酵母;3）構建可直接發(fā)酵纖維素和木糖的工程釀酒酵母。
　　發(fā)酵終點乙醇濃度越高，生產(chǎn)燃料乙醇精餾和脫水工段將節(jié)省更多能量。初始醪液濃度決定了發(fā)酵終點乙醇濃度，而木薯的高粘度特性限制了初始木薯醪液的濃度。最簡單的方法是玉米和木薯聯(lián)合發(fā)酵，當玉米占比達40％以上時，乙醇濃度可達到10

3、9.3 g·L-1，乙醇得率達到87％以上，分別比單獨木薯發(fā)酵時高9.4％和11％。為了完成木薯濃醪發(fā)酵，我們在拌料階段和發(fā)酵階段采用降粘酶進行降粘，優(yōu)化的拌料階段降粘酶配方為:液化酶12U·g-1，纖維素酶10 U·g-1，木聚糖酶5U·g-1，酸性果膠酶8 U·g-1;優(yōu)化的同步糖化發(fā)酵階段降粘酶配方:糖化酶150 U·g-1，普魯蘭酶0.08 U·g-1，酸性蛋白酶10 U·g-1，纖維素酶10 U·g-1，木聚糖酶5U·g-1。

4、采用同步糖化發(fā)酵方式，當發(fā)酵38％(w·v-1)木薯醪液時，原料淀粉利用率達到94.47％，終點乙醇濃度達到140 g·L-1，平均乙醇生產(chǎn)速率達到2.86 g·L-1·h-1。降粘酶的添加增加了酶投入成本，而原料出酒率的提高減少木薯原料的使用，使得總投入成本降低。
　　木質纖維素水解液中的第二大糖類-木糖由于不能有效地釀酒酵母轉化為乙醇而阻礙了纖維素乙醇的商業(yè)化應用。首先，我們通過在Saccharomyces cerevisia

5、eYS58聯(lián)合表達外源的木糖還原酶(xylosereductase，XR)基因XYL1，突變木糖還原酶[XR(R276H)]基因mXYL1，木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase，XDH)基因XYL2和內源的木酮糖激酶(xylulokinase，XK)基因XKS1獲得了工程酵母YSX4，實現(xiàn)了釀酒酵母對木糖的利用。YSX4發(fā)酵木糖和葡萄糖時木糖消耗速率為0.57g·L-1·h-1，而發(fā)酵木糖和麥芽糖時木糖消耗速率為0.

6、7g·L-1·h-1，糖的同步消耗有助于木糖代謝。進一步，我們在YSX4上聯(lián)合表達核酮糖-1，5-2P羧化酶[Form-Ⅱ ribulose bisphosphatecarboxylase-oxygenase(Rubisco)]基因cbbM，磷酸核酮糖激酶(phosphoribulokinase，PRK))基因sPRK和分子伴侶(chaperone)基因GroEL-GroES構建了形式-Ⅱ的CO2固定系統(tǒng)，獲得工程酵母YSX4C111;

7、或聯(lián)合表達來自Ralstonia eutropha H16的Form-Ⅰ Rubisco基因cbbL1-cbbS1，PRK基因cfxP1和S.cerevisiae內源chaperone基因HSP60-HSP10構建了形式-Ⅰ CO2固定系統(tǒng)，獲得工程酵母YSX4C222。當發(fā)酵麥芽糖和木糖時，YSX4C111和YSX4C222的木糖消耗速率分別達到0.97 g·L-1·h-1和1.1 g·L-1·h-1。YS X4C222總糖消耗速率和

8、總乙醇得率為3.1 g·L-1·h-1和0.47 g·g-1，分別比對照菌YSX4C000高63％和15％。測得YSX4C222的Rubisco胞外羧化酶活性也最高。我們評估不同時間段的相對CO2通量，約8％來自木糖的核酮糖通過CO2途徑被轉化為乙醇。通過計算工程酵母的CO2固定速率，YSX4C111和YSX4C222的平均CO2固定速率分別達到336.6和436.3 mg·L-1·h-1，遠高于自然的或工程化的可固定CO2微生物的CO

9、2固定速率(5.8-147.0 mg·L-1·h-1)。
　　可發(fā)酵糖和纖維素整合工藝(Consolidated bioprocessing，CBP)對于利用菌株以纖維素為底物發(fā)酵產(chǎn)乙醇是最有前景的選擇。我們通過代謝工程和基因工程手段實現(xiàn)工程S.cerevisiae在有限接種條件下聯(lián)合發(fā)酵纖維素和蔗糖或木糖?；谥皹嫿ǖ陌肴樘呛屠w維素聯(lián)合發(fā)酵菌株，我們首先用組成型啟動子替換了纖維小體表達和組裝的誘導型啟動子。構建的工程菌EBY1

10、01-CC在聯(lián)合發(fā)酵羧甲基纖維素(Carboxy Methylated Cellulose，CMC)和蔗糖時，以蔗糖分批補料方式進行發(fā)酵，10 g·L-1 CMC能完全被消耗且生產(chǎn)4.3 g·L-1乙醇，總乙醇得率為0.43 g·g-1。在此菌株基礎上進一步構建木糖代謝途徑和強化纖維素降解功能，獲得的工程菌EBY101-X5CC和EBY101-X5CP分別發(fā)酵木糖和CMC或磷酸膨脹纖維素(phosphoric acid-swollen