我國嗜熱彎曲菌PCR和核酸探針檢測方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、本研究建立了檢測我國嗜熱彎曲菌的PCR和核酸探針檢測方法，簡化了檢驗(yàn)流程、提高檢測效率，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測。選擇空腸/結(jié)腸彎曲菌同源性較高的16SrRNA為擴(kuò)增目的基因，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，建立快速檢測雞肉中空腸/結(jié)腸彎曲菌的PCR方法。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性4min、94℃變性30s、57℃退火30s、72℃延伸1min，25個(gè)循環(huán)后再72℃徹底延伸4min。最佳反應(yīng)條件為：模板10-3倍稀釋，引物最佳濃度

2、為0.4μmol/L，MgCl2最佳濃度為1.0mmol/L。該方法能夠特異性的擴(kuò)增出空腸/結(jié)腸彎曲菌287bp核苷酸片段，而對(duì)胎兒彎曲菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、腸炎沙門氏菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿假單胞菌和單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌等非空腸/結(jié)腸彎曲菌均不能擴(kuò)增出目的片段，敏感性試驗(yàn)的檢測限度為5cfu/mL。 在PCR方法建立的基礎(chǔ)上，在已擴(kuò)增的特異性和敏感性較好的空腸/結(jié)腸彎曲菌16SrRNA上

3、設(shè)計(jì)核酸探針，探針大小21bp，具有寡核苷酸探針的優(yōu)點(diǎn)。此方法利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)吖啶酯標(biāo)記寡核苷酸探針，所設(shè)計(jì)的探針能夠與目的核苷酸探針雜交，形成DNA-RNA雜交體，雜交后無需分離步驟，利用差分水解(Differentialhydrolysis)鑒別，即先加入弱堿性溶液，未經(jīng)雜交的發(fā)光探針失去發(fā)光特性(半衰期小于1min)，而與靶細(xì)胞雜交的探針可以保護(hù)吖啶酯不在堿性環(huán)境下水解。因?yàn)檫灌テ矫娼Y(jié)構(gòu)鑲嵌于雜交體雙螺旋的內(nèi)部，受到空間位阻的保

4、護(hù)，水解速度緩慢(半衰期10min以上)，仍有發(fā)光性能，再加入堿性H2O2進(jìn)行檢測時(shí)，能夠在發(fā)光儀上檢測到發(fā)光，整個(gè)試驗(yàn)過程只需要30min。此方法稱為核酸雜交保護(hù)分析，目前在我國還很少應(yīng)用。 取空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)株的純培養(yǎng)菌落進(jìn)行核酸雜交保護(hù)分析的試驗(yàn)，通過條件的篩選和優(yōu)化，此方法能夠特異性的檢測出空腸/結(jié)腸彎曲菌，而對(duì)胎兒彎曲菌、腸炎沙門氏菌、大腸埃希菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌、綠膿假單胞菌、單增李斯特桿菌等非空腸/結(jié)腸彎曲

5、菌均檢測為陰性結(jié)果。挑取不同個(gè)數(shù)的陽性菌落進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，最低檢測限度為1個(gè)菌落。 將建立的PCR方法和核酸雜交保護(hù)分析方法應(yīng)用于送檢的100份雞肉樣品的檢測，在分離培養(yǎng)的過程中，分別提取雞肉肉水、增菌液和純培養(yǎng)菌落進(jìn)行PCR檢測，對(duì)純培養(yǎng)菌落進(jìn)行核酸雜交保護(hù)分析檢測，并與常規(guī)生化鑒定結(jié)果對(duì)比，PCR檢測陽性率分別為16﹪(16/100)、24﹪(24/100)和20﹪(20/100)，核酸雜交保護(hù)分析檢測陽性率為20﹪(20/