我國嗜熱彎曲菌PCR和核酸探針檢測方法的建立與應用.pdf

1、本研究建立了檢測我國嗜熱彎曲菌的PCR和核酸探針檢測方法，簡化了檢驗流程、提高檢測效率，并應用于實際樣品的檢測。選擇空腸/結(jié)腸彎曲菌同源性較高的16SrRNA為擴增目的基因，應用Primer5.0軟件設計引物，建立快速檢測雞肉中空腸/結(jié)腸彎曲菌的PCR方法。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預變性4min、94℃變性30s、57℃退火30s、72℃延伸1min，25個循環(huán)后再72℃徹底延伸4min。最佳反應條件為：模板10-3倍稀釋，引物最佳濃度

2、為0.4μmol/L，MgCl2最佳濃度為1.0mmol/L。該方法能夠特異性的擴增出空腸/結(jié)腸彎曲菌287bp核苷酸片段，而對胎兒彎曲菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、腸炎沙門氏菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿假單胞菌和單核細胞增生性李斯特氏菌等非空腸/結(jié)腸彎曲菌均不能擴增出目的片段，敏感性試驗的檢測限度為5cfu/mL。 在PCR方法建立的基礎(chǔ)上，在已擴增的特異性和敏感性較好的空腸/結(jié)腸彎曲菌16SrRNA上

3、設計核酸探針，探針大小21bp，具有寡核苷酸探針的優(yōu)點。此方法利用化學發(fā)光物質(zhì)吖啶酯標記寡核苷酸探針，所設計的探針能夠與目的核苷酸探針雜交，形成DNA-RNA雜交體，雜交后無需分離步驟，利用差分水解(Differentialhydrolysis)鑒別，即先加入弱堿性溶液，未經(jīng)雜交的發(fā)光探針失去發(fā)光特性(半衰期小于1min)，而與靶細胞雜交的探針可以保護吖啶酯不在堿性環(huán)境下水解。因為吖啶酯平面結(jié)構(gòu)鑲嵌于雜交體雙螺旋的內(nèi)部，受到空間位阻的保

4、護，水解速度緩慢(半衰期10min以上)，仍有發(fā)光性能，再加入堿性H2O2進行檢測時，能夠在發(fā)光儀上檢測到發(fā)光，整個試驗過程只需要30min。此方法稱為核酸雜交保護分析，目前在我國還很少應用。 取空腸彎曲菌標準株的純培養(yǎng)菌落進行核酸雜交保護分析的試驗，通過條件的篩選和優(yōu)化，此方法能夠特異性的檢測出空腸/結(jié)腸彎曲菌，而對胎兒彎曲菌、腸炎沙門氏菌、大腸埃希菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌、綠膿假單胞菌、單增李斯特桿菌等非空腸/結(jié)腸彎曲

5、菌均檢測為陰性結(jié)果。挑取不同個數(shù)的陽性菌落進行敏感性試驗，最低檢測限度為1個菌落。 將建立的PCR方法和核酸雜交保護分析方法應用于送檢的100份雞肉樣品的檢測，在分離培養(yǎng)的過程中，分別提取雞肉肉水、增菌液和純培養(yǎng)菌落進行PCR檢測，對純培養(yǎng)菌落進行核酸雜交保護分析檢測，并與常規(guī)生化鑒定結(jié)果對比，PCR檢測陽性率分別為16﹪(16/100)、24﹪(24/100)和20﹪(20/100)，核酸雜交保護分析檢測陽性率為20﹪(20/