高效液相色譜鑒別糖胺聚糖種類方法的建立及其應(yīng)用.pdf

1、本文利用反相高效液相色譜法建立了糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAGs)種類的鑒別方法。根據(jù)糖胺聚糖及其衍生物不同結(jié)構(gòu)類型的單糖組成不同,采用柱前衍生反相高效液相色譜法(reversed phase-high performance liquid chromatography, RP-HPLC)實(shí)現(xiàn)了甘露糖(mannose, Man)、葡萄糖胺(glucosamine, GlcN)、甘露糖胺(mannosamine,

2、 ManN)、半乳糖胺(galactosamine, GalN)、葡萄糖醛酸(glucouronic acid, GlcA)、艾杜糖醛酸(iduronic acid, IdoA)、半乳糖醛酸(galacturonic acid, GalA)、葡萄糖(glucose, Glc)、半乳糖(galactose, Gal)和木糖(xylose, Xyl)單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合物在C18柱上的有效分離;利用不同類型糖胺聚糖不完全酸水解產(chǎn)物中耐酸水解二糖結(jié)

3、構(gòu)不同,實(shí)現(xiàn)了對(duì)肝素/硫酸乙酰肝素(heparin/heparan sulfate, Hp/HS)、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素(chondroitin sulfate/dermatan sulfate, CS/DS)和透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)的鑒別。所建立的方法成功用于依諾肝素鈉中GlcN和ManN摩爾比及海洋魚(yú)鰓組織中雜合硫酸軟骨素的分析測(cè)定,為低分子肝素的質(zhì)量控制和海洋生物中復(fù)雜GAGs的結(jié)構(gòu)類型鑒別提供了新的

4、途徑。
　　本文第一部分應(yīng)用RP-HPLC建立了GAGs種類鑒別方法。首先,在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上,對(duì)柱前衍生RP-HPLC方法的分離條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定了適于Man、GlcN、ManN、GalN、GlcA、IdoA、GalA、Glc、Gal和Xyl單糖標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)分離的最佳條件,即在柱溫30℃和流速1.0 mL/min下,以流動(dòng)相0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0)–乙腈先在85:15(v:v)下洗脫25 min,再在8

5、3:17比例下洗脫25 min。該方法從單糖組成的角度實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同種類GAGs的鑒別。在此基礎(chǔ)之上,對(duì)GAGs不完全酸水解產(chǎn)物進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了可以同時(shí)區(qū)分Hp/HS、CS/DS和HA的耐酸水解組分,經(jīng)質(zhì)譜和高效陰離子交換色譜分析,確定這三類耐酸水解組分的結(jié)構(gòu)分別為 GlcNα1→4IdoA/GlcA、GlcAβ/IdoAα1→3GalN和GlcAβ1→3GlcN。這三類結(jié)構(gòu)不同的二糖可用于Hp、CS和HA的定量分析,其檢測(cè)限可達(dá)納克級(jí)。

6、
　　本文第二部分應(yīng)用建立的RP-HPLC方法測(cè)定了依諾肝素中GlcN和ManN的摩爾比。首先,通過(guò)分子排阻-多角度激光散射聯(lián)用法、強(qiáng)陰離子交換-高效液相色譜法和核磁共振波譜法分別對(duì)8種不同依諾肝素進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明8種依諾肝素均符合USP35標(biāo)準(zhǔn)。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)優(yōu)化GlcN和ManN降解時(shí)間準(zhǔn)確測(cè)定了二者的摩爾比,初步確定依諾肝素中GlcN和ManN摩爾比的合理范圍為16.4～19.1。
　　本文第三部分利用已建立

7、的 RP-HPLC方法鑒定了海洋魚(yú)鰓組織中的雜合硫酸軟骨素,并采用二糖組成分析法、聚丙烯凝膠電泳法和核磁共振波譜法對(duì)已鑒定的雜合硫酸軟骨素進(jìn)行了結(jié)構(gòu)驗(yàn)證。結(jié)果表明本文建立的RP-HPLC方法對(duì)魚(yú)鰓組織中的雜合硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)的鑒定是正確可靠的,這些雜合硫酸軟骨素主要由→4GlcAβ1→3GlcNAc4Sβ1→(CSA)、4GlcAβ1→3GlcNAc6Sβ1→(CSC)和→4IdoAα1→3GlcNAc4Sβ1→(DS)重復(fù)結(jié)構(gòu)單元共價(jià)雜