高效液相色譜鑒別糖胺聚糖種類方法的建立及其應用.pdf

1、本文利用反相高效液相色譜法建立了糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAGs)種類的鑒別方法。根據(jù)糖胺聚糖及其衍生物不同結(jié)構(gòu)類型的單糖組成不同,采用柱前衍生反相高效液相色譜法(reversed phase-high performance liquid chromatography, RP-HPLC)實現(xiàn)了甘露糖(mannose, Man)、葡萄糖胺(glucosamine, GlcN)、甘露糖胺(mannosamine,

2、 ManN)、半乳糖胺(galactosamine, GalN)、葡萄糖醛酸(glucouronic acid, GlcA)、艾杜糖醛酸(iduronic acid, IdoA)、半乳糖醛酸(galacturonic acid, GalA)、葡萄糖(glucose, Glc)、半乳糖(galactose, Gal)和木糖(xylose, Xyl)單糖標準品混合物在C18柱上的有效分離;利用不同類型糖胺聚糖不完全酸水解產(chǎn)物中耐酸水解二糖結(jié)

3、構(gòu)不同,實現(xiàn)了對肝素/硫酸乙酰肝素(heparin/heparan sulfate, Hp/HS)、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素(chondroitin sulfate/dermatan sulfate, CS/DS)和透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)的鑒別。所建立的方法成功用于依諾肝素鈉中GlcN和ManN摩爾比及海洋魚鰓組織中雜合硫酸軟骨素的分析測定,為低分子肝素的質(zhì)量控制和海洋生物中復雜GAGs的結(jié)構(gòu)類型鑒別提供了新的

4、途徑。
　　本文第一部分應用RP-HPLC建立了GAGs種類鑒別方法。首先,在實驗室前期工作的基礎上,對柱前衍生RP-HPLC方法的分離條件進行了優(yōu)化,確定了適于Man、GlcN、ManN、GalN、GlcA、IdoA、GalA、Glc、Gal和Xyl單糖標準品同時分離的最佳條件,即在柱溫30℃和流速1.0 mL/min下,以流動相0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0)–乙腈先在85:15(v:v)下洗脫25 min,再在8

5、3:17比例下洗脫25 min。該方法從單糖組成的角度實現(xiàn)了對不同種類GAGs的鑒別。在此基礎之上,對GAGs不完全酸水解產(chǎn)物進行分析,發(fā)現(xiàn)了可以同時區(qū)分Hp/HS、CS/DS和HA的耐酸水解組分,經(jīng)質(zhì)譜和高效陰離子交換色譜分析,確定這三類耐酸水解組分的結(jié)構(gòu)分別為 GlcNα1→4IdoA/GlcA、GlcAβ/IdoAα1→3GalN和GlcAβ1→3GlcN。這三類結(jié)構(gòu)不同的二糖可用于Hp、CS和HA的定量分析,其檢測限可達納克級。

6、
　　本文第二部分應用建立的RP-HPLC方法測定了依諾肝素中GlcN和ManN的摩爾比。首先,通過分子排阻-多角度激光散射聯(lián)用法、強陰離子交換-高效液相色譜法和核磁共振波譜法分別對8種不同依諾肝素進行了結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明8種依諾肝素均符合USP35標準。在此基礎上,通過優(yōu)化GlcN和ManN降解時間準確測定了二者的摩爾比,初步確定依諾肝素中GlcN和ManN摩爾比的合理范圍為16.4～19.1。
　　本文第三部分利用已建立

7、的 RP-HPLC方法鑒定了海洋魚鰓組織中的雜合硫酸軟骨素,并采用二糖組成分析法、聚丙烯凝膠電泳法和核磁共振波譜法對已鑒定的雜合硫酸軟骨素進行了結(jié)構(gòu)驗證。結(jié)果表明本文建立的RP-HPLC方法對魚鰓組織中的雜合硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)的鑒定是正確可靠的,這些雜合硫酸軟骨素主要由→4GlcAβ1→3GlcNAc4Sβ1→(CSA)、4GlcAβ1→3GlcNAc6Sβ1→(CSC)和→4IdoAα1→3GlcNAc4Sβ1→(DS)重復結(jié)構(gòu)單元共價雜