飯豆根尖早期鋁應答基因的鑒定與功能分析.pdf

1、飯豆(Vigna umbellata)是一種在酸性土壤中生長表現(xiàn)良好的豆類作物。前期研究表明，鋁(Al)誘導飯豆根尖檸檬酸的分泌有數(shù)小時的滯后期，暗示蛋白的重新合成是分泌所必需的，但這一過程中所涉及的調控基因仍不得而知;介導Al誘導飯豆檸檬酸分泌的轉運子基因VuMATE1在無Al條件不被轉錄，而在Al脅迫下被大量誘導表達，因此鑒定飯豆早期Al響應基因可以為飯豆根尖檸檬酸分泌調控提供有價值的信息;高濃度Al在顯著抑制根伸長的同時往往會引發(fā)

2、細胞次級脅迫的產(chǎn)生，這不利于辨別真正的Al脅迫靶標。在本研究中，為鑒定調控飯豆檸檬酸分泌的新組分，揭示飯豆Al耐性和毒性相關的分子機制。我們構建了低濃度和高濃度Al脅迫早期的抑制差減文庫(Suppression subtractivehybridization，SSH)，從中鑒定了一批Al上調和下調的差異表達基因，并對其進行了分析。同時，對其中一個潛在的可能參與檸檬酸分泌調控的轉錄因子基因VuSTOP1進行了研究。主要研究結果如下：

3、r>　?、懦晒嫿孙埗?和25μM AlCl3處理4h的正反向差減文庫。結合反向Nothern雜交和定量PCR鑒定到815個差異表達的EST序列，這些序列代表了394個Unigenes。根據(jù)Gene Ontology分類顯示，這些Unigenes可以被歸類為“信號轉導與轉錄”，“轉運”，“脅迫/防御應答”，“代謝與能量”，“細胞壁合成與結構”，“細胞分化與細胞骨架”，“蛋白質翻譯進程與降解”，“DNA與RNA代謝”，“未知功能”以及“

4、無匹配”10個功能大類。在已知功能基因中，與“代謝與能量”，“信號轉導與轉錄”以及“轉運”相關的基因被優(yōu)勢上調表達，而與“蛋白翻譯進程與降解”相關的基因被優(yōu)勢下調表達。對兩個處理濃度下差異基因的表達譜分析發(fā)現(xiàn)，調控檸檬酸分泌基因的上調在飯豆應答低濃度和高濃度Al脅迫的耐性機制中扮演了重要的作用;代謝（能量）和蛋白合成的改變是飯豆應答Al脅迫時的自發(fā)適應性機制并可能與Al的耐性相關;高濃度Al對飯豆根伸長的抑制可能與水分和礦質營養(yǎng)元素運輸

5、以及細胞分化相關基因的下調有關。
　?、聘鶕?jù)文庫中鑒定到的EST序列信息，通過Rapid-amplification of cDNAends(RACE) PCR技術從飯豆中擴增了一個STOP1類直系同源基因，命名為VuSTOP1。序列分析顯示，該基因cDNA全長1772 bp，能夠剪切形成兩個轉錄本，其中VuSTO1.1長1497 bp，編碼498個氨基酸，VuSTOP1.2長1263 bp，編碼420個氨基酸。氨基酸同源性比對及

6、進化樹分析表明，VuSTOP1與其它已知物種中的STOP1類蛋白一樣，擁有4個高度保守的Cys2His2鋅指蛋白結構域，在進化關系上，與菜豆親緣關系最近，其次是大豆。Southern雜交顯示，VuSTOP1是一個單拷貝基因。對兩個轉錄本的定量PCR分析表明，VuSTOP1.1與VuSTOP1.2表達模式基本一致，主要在飯豆根中表達，其中基本根(1-2 cm)中的表達量高于根尖(0-1 cm)，而在葉中的表達量最低，Al和蛋白合成抑制劑亞

7、胺環(huán)已酮(Cycloheximide)能顯著誘導其表達量的增加，低pH和重金屬鎘(Cd)可輕微上調其表達。進一步對VuSTOP1基本特性進行分析顯示，VuSTOP1定位于細胞核中，具有兩個轉錄激活域，分別位于N端1-78氨基酸殘基和C端389-498氨基酸殘基區(qū)間。利用擬南芥AtSTOP1啟動子接VuSTOP1回復到擬南芥同源stop1突變體中發(fā)現(xiàn)，VuSTOP1可以通過回復AtSTOP1調控的H+耐性基因較大程度地回復stop1的H+