毛細(xì)管液相色譜熱膨脹泵及蛋白質(zhì)微分離新方法研究.pdf

1、微型化是現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展的一個趨勢，在分析化學(xué)領(lǐng)域尤其如此。為降低樣品消耗量和分析成本，提高分析靈敏度和分析速度，減少環(huán)境污染，發(fā)展微型化分析儀器，微分離分析已成為現(xiàn)代色譜研究的重要方向，研究熱點(diǎn)集中于毛細(xì)管液相色譜、毛細(xì)管電泳及微流控芯片三方面，與之相配套的分析儀器及分離分析技術(shù)與方法都得到了迅猛發(fā)展。其中，微流量輸液泵是微分離分析系統(tǒng)的關(guān)鍵部件，液體的微流量驅(qū)動與控制技術(shù)是實(shí)現(xiàn)微分離分析的前提和基礎(chǔ)，而蛋白質(zhì)的微分離分析研究有助于人

2、們從更深層次認(rèn)識生命活動的規(guī)律。目前，微流量高壓輸液泵是制約毛細(xì)管液相色譜發(fā)展和液相色譜微型化方面的瓶頸之一，而微量、低濃度、復(fù)雜蛋白質(zhì)的分離分析也是研究者致力于解決的問題。本論文針對微流量輸液泵和蛋白微分離分析研究中的熱點(diǎn)難點(diǎn)問題，研制出能夠連續(xù)恒流輸出并用于實(shí)際操作的毛細(xì)管液相色譜熱膨脹泵，發(fā)展了低濃度蛋白的固相熒光衍生檢測和微量復(fù)雜蛋白雙相柱分離分析新方法。全文共分五章，主要內(nèi)容如下：
　　第一章，文獻(xiàn)綜述。本章總結(jié)了微流量

3、輸液泵及相應(yīng)的液體微流量驅(qū)動與控制技術(shù)，概述了液相色譜微流泵的特殊要求和發(fā)展現(xiàn)狀，介紹了蛋白質(zhì)微分離分析常用的分離技術(shù)和檢測技術(shù)，最后，闡述了本論文的選題意義。
　　第二章，采用液體熱膨脹原理的微流量高壓輸液泵的基礎(chǔ)研究。熱膨脹泵無動態(tài)密封，無單向閥等活動部件，不需高精度的機(jī)械加工，成本只有同類設(shè)備的10％甚至更低，更避免了傳統(tǒng)機(jī)械泵所固有的機(jī)械脈動、動態(tài)密封滲漏及磨損問題，無需分流可實(shí)現(xiàn)微流量高壓輸出，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，同時便于實(shí)現(xiàn)微型

4、化。本章系統(tǒng)梳理了以耐壓腔體內(nèi)液體體積受熱膨脹為根本驅(qū)動力的微流泵的輸液過程，詳細(xì)分析了體積熱膨脹、液體壓縮及輸液過程中泵腔內(nèi)液體質(zhì)量損失對流量輸出的影響，討論了壓力對體積熱膨脹系數(shù)的影響，針對實(shí)際應(yīng)用引入泵初始化溫度等一系列修正，發(fā)展完善了熱膨脹泵輸液理論及通過控制溫度來精確控制微流量輸出的方程，使理論脈絡(luò)更清晰，方程更實(shí)用。隨后，我們根據(jù)上述理論和方程，選擇水為工作對象，計算確定了適合毛細(xì)管高效液相色譜流量要求的泵腔體積，使用高強(qiáng)度

5、金屬作為泵體材料，采用電熱源直接加熱法和PID溫度控制系統(tǒng)對泵體實(shí)施高精度溫度控制，加工制造出模型機(jī)，對其基礎(chǔ)性能進(jìn)行了考察并優(yōu)化了熱膨脹泵的加熱方式和泵體設(shè)計。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用液體熱膨脹的原理，對于一定體積的受熱液體，通過程序升溫控制可以實(shí)現(xiàn)10-9~10-5L/min內(nèi)微流量的精確輸出，其輸出壓力可達(dá)到10MPa以上，并有望應(yīng)用于UPLC系統(tǒng)。我們還對微型化熱膨脹泵-納流泵進(jìn)行了初步研究。
　　第三章，首次研制出具備連續(xù)恒流

6、輸液能力的毛細(xì)管液相色譜熱膨脹泵并成功應(yīng)用于nano-HPLC。該泵由四元耐壓加熱泵體、微流泵程控系統(tǒng)、切換閥、壓力傳感器等連接構(gòu)成。我們采用上一章發(fā)展完善的熱膨脹輸液理論和流量輸出控制方程，設(shè)計了雙十通閥切換熱膨脹泵系統(tǒng)，以“多泵聯(lián)用-閥切換輪替”的方式，實(shí)現(xiàn)了10-5～10-9L/min范圍內(nèi)微流量的連續(xù)恒流輸出；發(fā)明了“雙壓力平衡程控閥切換”技術(shù)，進(jìn)一步保證了熱膨脹泵運(yùn)行過程中系統(tǒng)壓力和流量輸出的穩(wěn)定性；在儀器化梯度生成方法的探索

7、上也取得了有益的進(jìn)展，可以實(shí)現(xiàn)包括臺階式梯度、線性梯度等梯度流型的微流量輸出。該熱膨脹微流泵系統(tǒng)應(yīng)用于nano-HPLC顯示出良好的輸液性能，500nL/min時輸液穩(wěn)定性RSD=4％，色譜峰保留值RSD小于2％。隨后，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了建立以熱膨脹微流泵為驅(qū)動的nano-HPLC與激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測器聯(lián)用的國產(chǎn)分離檢測系統(tǒng)的可行性，拓展了熱膨脹微流泵的應(yīng)用范圍。
　　第四章，發(fā)展了用于低濃度蛋白樣品熒光衍生的毛細(xì)管固相微反

8、應(yīng)器新方法，研究并優(yōu)化了蛋白固相熒光標(biāo)記的反應(yīng)條件，能實(shí)現(xiàn)10-8M和pmol量級蛋白的衍生和檢測，并將該方法成功應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析。本章采用溶膠凝膠法及勻漿填充法相結(jié)合的方法，在毛細(xì)管中制備了用于蛋白熒光標(biāo)記的固相載體填充床，不需精密微加工技術(shù)，采用商業(yè)色譜填料，制備方法簡單易行；選擇熒光素異硫氰酸酯(FITC)作為熒光衍生試劑，發(fā)展了蛋白的固相熒光衍生方法，將固相萃取與固相衍生結(jié)合起來，可以方便的處理小體積樣品和低濃度樣品，取得了

9、優(yōu)于傳統(tǒng)溶液衍生的效果；發(fā)展了基于毛細(xì)管體積排阻色譜的微升級熒光衍生蛋白純化方法，有效降低熒光小分子的干擾。該方法為拓展蛋白熒光檢測在微分離分析中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
　　第五章，發(fā)展建立了弱陰離子交換-反相(WAX-RPLC)雙相柱納流液相色譜兩維分離系統(tǒng)，結(jié)合高靈敏度的激光誘導(dǎo)熒光(UF)檢測方法，用于微量蛋白復(fù)雜體系的微分離分析。我們將兩種不同的固定相--WAX和RPLC填料，分段裝填在一根毛細(xì)管柱內(nèi)，既充分利用兩種分離模式的

10、正交性有效提高了分離體系峰容量，又減少了兩維連接中的死體積和分析系統(tǒng)的復(fù)雜性，避免了微量樣品在多維毛細(xì)管液相色譜閥切換中的損失和復(fù)雜的接口制作工藝。本章描述了該兩維系統(tǒng)的構(gòu)建方法，以蛋白質(zhì)酶解肽段混合物和微量人胚腎細(xì)胞提取蛋白為樣品，建立了雙相柱兩維分離的工作流程，對體系的性能優(yōu)化和實(shí)際分離能力進(jìn)行了初步考察，具有制作簡單，操作方便，靈敏度高、峰容量大的優(yōu)點(diǎn)，為微量蛋白復(fù)雜體系的微分離分析提供了一條可行的技術(shù)路線。
　　綜上所述，

11、本論文圍繞微流量輸液泵和蛋白微分離分析研究中的熱點(diǎn)難點(diǎn)問題，研制了毛細(xì)管液相色譜熱膨脹泵，發(fā)展完善了熱膨脹輸液理論，實(shí)現(xiàn)了熱膨脹泵高壓下微流量連續(xù)恒流輸出的技術(shù)突破并成功應(yīng)用于nano-HPLC，有助于解決液相色譜微流泵高壓輸液和微型化方面的難題，也有利于我國分析儀器事業(yè)實(shí)現(xiàn)跨越式發(fā)展，無論在科學(xué)研究還是技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域都具有重要意義；同時發(fā)展的低濃度蛋白樣品固相熒光衍生方法和弱陰離子交換-反相色譜雙相柱納流高效液相色譜分離-激光誘導(dǎo)熒光檢